Mitsuaria sp.141壳聚糖酶基因的克隆、表达与酶学分析

论文摘要

壳聚糖酶是对线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶。使用壳聚糖酶通过降解生产得到的壳寡糖（Chitooligosaccharides,简称CHOS）具有多种生物学功能,在食品添加剂、医药保健、诊断试剂等方面有着非常诱人的前景,并且在工业上使用壳聚糖酶生产CHOS具有高效、环保等优点,因此寻找高效的专一性壳聚糖酶已经成为该领域中研究的热点。目前商业化的壳聚糖酶很少,并且都不能很好的满足工业化生产CHOS的需求。本实验室从南湖边虾壳堆积处筛选到一株诱导型产壳聚糖酶的细菌,经鉴定命名为Mitsuaria sp.141,该细菌在500 mL摇瓶中以适当的条件发酵2d酶活达到4U/mL。基于这一较高的酶活,本研究的主要目的是从该细菌中克隆壳聚糖酶基因,利用基因工程技术实现高效表达,满足工业生产的需求。本研究提取Mitsuaria sp.141的总DNA,通过PCR技术扩增得到壳聚糖酶的编码基因choAl,该基因全长1176 bp, GC含量64.46%,编码391个氨基酸,其中N端80个氨基酸为信号肽。通过BLAST比对,属于糖苷水解酶（GH）80号家族。为了使这一壳聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达,将choA1基因进行以下四方面的改变：（1）去掉信号肽（2）密码子优化（3）GC含量调整（4）降低mRNA二级结构能值,然后将优化前的原始基因序列ori-choA1和优化后合成的序列opt-choA1分别插入到毕赤酵母表达载体pPIC9K的SnaBⅠ与AvrⅡ酶切位点之间,构建重组表达质粒pPIC9K-ori-choA1和pPIC9K-opt-choA1。两个重组质粒用SacⅠ和DraⅠ分别进行单酶切线性化后转化至毕赤酵母,从而得到基因序列和甲醇利用速度不同的四种工程菌株：ori-mut+、ori-must、opt-mut+、opt-muts。这四种工程菌通过G418平板筛选后,得到一株抗性和酶活最高的菌株opt-muts 3#,该菌株采用500 mL摇瓶发酵4 d的粗酶液酶活为55.6 U/mL,采用50 L发酵罐发酵140 h的粗酶液酶活达到422 U/mL。Mitsuaria sp.141所产壳聚糖酶的分子量在SDS-PAGE胶图中表现为33.6 kDa,而从毕赤酵母中纯化的重组酶却显示弥散的条带,分子量为38-55 kDa。质谱分析结果表明该弥散条带中蛋白的氨基酸序列与choA1编码的壳聚糖酶CHOA1的相同,Western blot实验也表明该蛋白是带有his-tag标签的。去糖基化酶验证表明,重组表达的壳聚糖酶被部分N-糖基化,造成电泳时出现弥散的蛋白条带。本课题还研究了Mitsuaria sp.141的壳聚糖酶native-CHOA1和重组壳聚糖酶recombinant-CHOA1的酶学性质,两者的最适反应底物都是胶体壳聚糖,参与酶促反应的最适pH都是5.5, native-CHOA1的最适反应温度为65℃,而recombinant-CHOA1的最适反应温度为55℃。本研究成果得到Mitsuaria sp.141的壳聚糖酶基因,并得到产酶效率较高的重组毕赤酵母菌株,在工业应用上有潜在的价值。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语表
• 1. 前言
• 1.1 壳聚糖与壳寡糖
• 1.2 壳聚糖酶
• 1.2.1 壳聚糖酶的来源与分类
• 1.2.2 壳聚糖酶的生化特性
• 1.2.3 壳聚糖酶的结构与作用机理
• 1.2.4 壳聚糖酶的开发前景
• 1.3 毕赤酵母表达系统
• 1.3.1 宿主菌株
• 1.3.2 表达载体
• 1.3.3 表达策略
• 1.3.4 发酵条件优化
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2. 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 菌株与质粒
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 生物学软件和网站
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 溶液
• 2.1.6 仪器设备
• 2.2 壳聚糖酶基因的克隆与测序
• 2.2.1 PCR扩增壳聚糖酶基因
• 2.2.2 大肠杆菌感受态的制备
• 2.2.3 TA克隆、转化与测序
• 2.3 壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达
• 2.3.1 密码子的优化
• 2.3.2 基因序列的PCR扩增与酶切
• 2.3.3 pPIC9K载体酶切、脱磷
• 2.3.4 酶连与大肠杆菌转化
• 2.3.5 毕赤酵母感受态的制备
• 2.3.6 重组质粒的转化
• 2.3.7 壳聚糖酶的诱导表达与酶活检测
• 2.3.8 高拷贝重组酵母的筛选
• 2.4 表达产物的纯化与检测
• 2.4.1 壳聚糖酶的纯化
• 2.4.2 TCA沉淀
• 2.4.3 SDS-PAGE检测
• 2.4.4 糖基化分析与Western blot检测
• 2.5 酶学性质研究
• 2.5.1 氨基葡萄糖标准曲线
• 2.5.2 壳聚糖酶酶活的测定
• 2.5.3 壳聚糖酶最适pH
• 2.5.4 壳聚糖酶最适反应温度
• 2.5.5 壳聚糖酶的底物特异性
• 2.5.6 金属离子与EDTA对壳聚糖酶活性的影响
• 2.6 高密度细胞发酵
• 2.6.1 种子液的培养
• 2.6.2 菌体生长阶段
• 2.6.3 甲醇诱导表达阶段
• 3. 结果与分析
• 3.1 壳聚糖酶基因的克隆与测序
• 3.1.1 基因组抽取
• 3.1.2 PCR扩增与测序
• 3.2 密码子优化
• 3.2.1 毕赤酵母、ori-choA1及opt-choA1基因的密码子使用情况比较
• 3.2.2 ori-choA1和opt-choA1的CAI值比较
• 3.2.3 ori-choA1和opt-choA1的GC含量分布
• 3.2.4 ori-choA1和opt-choA1的mRNA二级结构
• 3.3 毕赤酵母表达
• 3.3.1 重组质粒的构建及验证
• 3.3.2 重组酵母的验证
• 3.3.3 不同表型重组菌株的酶活比较
• 3.3.4 高拷贝数重组菌株的筛选
• 3.4 表达产物的检测与分析
• 3.4.1 SDS-PAGE检测
• 3.4.2 糖基化分析
• 3.4.3 Western blot检测糖基化
• 3.5 酶学性质分析
• 3.5.1 最适温度
• 3.5.2 最适pH
• 3.5.4 底物特异性
• 3.6 高密度细胞发酵
• 4. 小结与讨论
• 4.1 基因序列的优化
• 4.2 基因拷贝数的提高
• 4.3 壳聚糖酶酶活
• 4.4 发酵条件的优化
• 4.4.1 pH的优化
• 4.4.2 甲醇利用表型的选择
• 4.4.3 甲醇添加量的优化
• 4.4.4 菌体浓度
• 参考文献
• 致谢