转录因子AP-4在胃癌中的表达及其肿瘤生物学功能和机制的研究

论文摘要

第一部分转录因子AP-4在胃癌中的表达及临床意义目的检测转录因子AP-4在胃癌中的表达,探索AP-4基因在胃癌中的作用,以及AP-4在胃癌中的表达与临床病理资料之间的关系。方法2005～2007年间,收取胃癌组织标本98例与癌旁正常胃粘膜组织66例,采用免疫组织化学染色方法和免疫蛋白印迹法检测各组织中AP-4蛋白的表达,实时定量聚合酶链反应检测mRNA的表达。比较AP-4的表达与临床病理特征及预后的关系。结果免疫组化检测发现AP-4在肿瘤组织的阳性表达率为83.67%,高于正常组织的40.91%,差异有统计学意义（P<0.0001）；而且,AP-4的表达与肿瘤浸润深度（P<0.0001）,分化程度（P=0.0058）,淋巴结转移（P=0.0255）及pTNM分期（P=0.001）呈正相关；实时定量聚合酶链反应和免疫蛋白印迹检测胃癌组织中AP-4的相对表达也明显高于正常组织；生存分析发现,AP-4阳性表达患者的中位生存期明显短于阴性表达的患者（P=0.0011）。结论转录因子AP-4在肿瘤组织中呈明显高表达状态,其表达水平随着T、N、M分期和pTNM分期的升高而升高；而且,AP-4的高表达提示预后不良。因此,AP-4基因可能作为癌基因参与胃癌的发生和发展。第二部分下调AP-4的表达对胃癌细胞增殖和化疗药物效果的影响目的：探讨下调AP-4的表达对胃癌细胞体外增殖及其对化疗药物效果的影响。方法：以脂质体介导的AP-4特异性siRNAs转染胃癌AGS细胞,实时定量聚合酶链反应及免疫蛋白印迹法检测转染后不同时间点AP-4的表达情况,以转染了阴性对照siRNA和未转染siRNA的细胞作为对照。转染48小时后,使用MTT法检测siRNAs对细胞增殖的影响。转染后6小时,更换加入含有不同浓度化疗药物的培养基,48小时后再检测细胞增殖情况。结果：AP-4特异性siRNAs转染AGS细胞后,AP-4的下调于24小时就已经出现,持续至96小时,且在48和72小时时沉默效率最高。在转染48小时后,细胞的相对增殖率为：阴性对照组为98.52±7.32%,AP-4-siRNA-1组为66.28±1.79%,AP-4-siRNA-2组为61.55±2.33%,差异有统计学意义。siRNAs联合化疗药物作用于细胞,其相对的增殖抑制率为：5-Fu （10μg/ml）组：空白对照组为27.93±4.59%,阴性对照组为30.70±0.87%, AP-4-siRNA-1组为52.23±3.71%,AP-4-siRNA-2组为56.74±3.66%；5-Fu（20μg/ml）组：空白对照组为51.77±2.82%,阴性对照组为49.03±2.31%,AP-4-siRNA-1组为73.80±4.64%,AP-4-siRNA-2组为75.11±2.67%；顺铂（0.5μg/ml）组：空白对照组为20.65±4.71%,阴性对照组为18.30±3.13%,AP-4-siRNA-1组为50.66±3.05%,AP-4-siRNA-2组为61.54±3.64%；顺铂（1.0μg/ml）组：空白对照组为45.24±0.77%,阴性对照组为48.82±3.43%,AP-4-siRNA-1组为70.03±1.48%,AP-4-siRNA-2组为71.49±3.99%；阿霉素（0.4μg/ml）组：空白对照组为28.43±3.92%,阴性对照组为27.52±4.68%, AP-4-siRNA-1组为55.95±1.67%,AP-4-siRNA-2组为63.70±1.47%；阿霉素（0.6μg/ml）组：空白对照组为53.88±2.55%,阴性对照组为55.23±3.26%,AP-4-siRNA-1组为77.36±4.35%,AP-4-siRNA-2组为79.57±3.69%,AP-4特异性siRNAs组的抑制率与阴性对照组和空白对照组之间进行比较,差异有统计学意义。结论：AP-4的下调可以抑制细胞增殖,增加化疗药物对胃癌细胞的抑制作用,因此转录因子AP-4可能是促进胃癌发展,增加肿瘤细胞对化疗药物的耐药性。第三部分下调AP-4的表达对胃癌细胞周期阻滞和凋亡的影响目的：探讨AP-4的下调对胃癌细胞周期阻滞和凋亡的影响,并对其机制进行研究。方法：转染48小时后,使用流式细胞仪检测细胞周期阻滞和细胞凋亡情况,并且检测细胞周期调控基因p21、p53和cyclin D1的表达,和凋亡相关基因Bcl-2、Bcl-xL、Bax、Caspase-8和Caspase-9的表达情况。结果：转染48小时后,细胞周期分布为：空白对照组：GO/G1期48.44±2.35%,G2/M期18.91±0.52%, S期32.65±1.02%；阴性对照组：G0/G1期50.38±2.47%,G2/M期18.44±0.43%, S期31.235±0.98%；siRNA-1组：G0/G1期61.92±3.86%, G2/M期13.72±0.34%, S期24.36±0.96%；siRNA-2组：G0/G1期63.67±3.31%, G2/M期13.42±0.37%, S期22.91±0.89%；转染AP-4特异性siRNAs能够引起细胞周期阻滞于G0/G1期。进一步检测细胞周期调控基因p21、p53和cyclin D1的表达,结果发现下调AP-4的表达能够促进p21和p53的表达,而抑制cyclin D1的表达。转染AP-4特异性siRNAs后,细胞的凋亡率有明显的升高,AP-4特异性siRNAs组的凋亡率要明显高于对照组；转染后,AP-4特异性siRNAs组细胞的Bcl-2和Bcl-xL的mRNA水平明显低于阴性对照组和空白对照组,而Bax、Caspase-8和Caspase-9的mRNA水平高于阴性对照组和空白对照组,其差异有统计学意义。结论：AP-4的下调能够引起细胞周期阻滞和促进凋亡,可能与调控细胞周期相关基因和凋亡相关基因的表达有关。

论文目录

• 主要缩略词及中英文对照表
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 转录因子AP-4在胃癌中的表达及临床意义
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 下调AP-4的表达对胃癌细胞增殖和化疗药物效果的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 下调AP-4的表达对胃癌细胞周期阻滞和凋亡的影响
• 前言
• 材料和方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文总结
• 综述
• 参考文献
• 附录 攻读博士学位期间发表的学术论文
• 致谢