东亚钳蝎毒素BmαTX14的基因组克隆、真核表达纯化及其功能的初步研究

论文摘要

蝎毒素是一类由20-90个氨基酸构成的小分子多肽。这类小肽一般含3或4对二硫键,可以选择性地与动物可兴奋细胞膜上的钠、钾、钙、氯离子通道结合,影响离子通道的状态,成为研究离子通道生理作用和功能定位的重要工具之一。此外,在我国中医药学中,用全蝎镇痉、熄风、通络止痛、和攻毒散结己有悠久的历史。 根据从蝎毒腺cDNA文库中,分离得到的基因bmatx14的cDNA序列（447bp）设计引物,通过PCR方法,从东亚钳蝎基因组中扩增到由855bp组成的bmatx14的全长基因。序列分析表明bmatx14基因在编码信号肽的第16个氨基酸残基Gly的密码子的第一个碱基（G）后有一个408bp的内含子。其基因组结构分析表明:富含AT,含量达73.5%,明显高于外显子（57.6%）;5’、3’剪接位点序列分别为5’-AG|gtaaga-3’、5’-tgacag|GA-3’;在3’剪接受体位点上游74个碱基处含有一个剪接分枝点序列元件:5’-taat-3’。bmatx14基因组织结构具有典型的α型Na+通道毒素的特征。 蝎毒成分复杂,难以纯化,而且单体成分含量较低,因而蝎毒素的研究和应用受到了一定的限制。本研究利用毕赤酵母真核表达系统建立了蝎毒素的高效真核表达、纯化体系,纯化得到的重组BmαTX14经初步功能研究,表现出α型Na+通道毒素特性。将蝎毒bmatx14成熟肽cDNA扩增产物克隆至真核表达载体pPIC9K中,并在载体信号肽与成熟肽之间设计组氨酸标签（His-tag）。构建的重组表达载体转化毕赤酵母菌株GS115,多拷贝转化子经G418梯度筛选后,能够

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 前言
• 1 蝎的种类及分布
• 2 蝎毒素的组成和分类
• 2.1 钾通道蝎毒素
• 2.2 氯通道蝎毒素
• 2.3 钙通道蝎毒素
• 2.4 钠通道蝎毒素
• 3 蝎毒素研究概况
• 3.1 蝎毒素进化的研究
• 3.2 蝎毒素结构骨架的研究
• 3.3 蝎毒素杀虫剂的研究
• 3.4 蝎毒素的药用研究
• 4 蝎毒素基因的表达
• 4.1 蝎毒素表达的概况
• 4.2 真核表达系统简介
• 4.3 巴斯德毕赤酵母的生物学
• 4.4 巴斯德毕赤酵母表达载体
• 4.5 毕赤酵母表达外源蛋白的外部条件
• 第二章 东亚钳蝎蝎毒素bmαtx14基因组克隆及其基因组织结构分析
• 0 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料与试剂
• 1.2 方法
• 1.2.1 Buthus martensii Karsch总DNA的提取
• 1.2.2 bmαtx14基因组序列的PCR扩增
• 1.2.3 bmαtx14基因组序列的克隆、测序
• 2 结果与讨论
• 2.1 bmαtx14基因组序列的PCR扩增
• 2.2 基因组克隆测序及其序列结构
• 2.3 bmαtx14内含子序列的结构比较
• 3 讨论
• 第三章 东亚钳蝎毒素BmαTX14的真核表达与纯化及其产物的毒性研究
• 0 引言
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 质粒的小量制备
• 1.2.2 重组表达载体的构建
• 1.2.3 获得重组毕赤酵母GS115
• 1.2.4 高拷贝转化子的筛选
• 1.2.5 诱导表达和纯化
• 1.2.6 重组BmKIM的免疫印迹测定
• 1.2.7 重组BmKIM的蛋白定量和毒性测定
• 2 结果
• 2.1 重组毕赤酵母GS115（pPIC9K／BmαTX14）
• 2.2 重组BmαTX14的表达、纯化
• 2.3 重组BmαTX14的免疫印迹和定量
• 2.4 重组BmαTX14的毒性
• 3 讨论
• 参考文献
• 硕士期间发表和待发表的论文
• 致谢