RI基因稳定转染的SKOV3细胞系的建立及其对细胞增殖作用的研究

论文摘要

卵巢癌的死亡率居妇科恶性肿瘤之首,由于发病隐匿,缺乏早期症状,大约有75%的患者确诊时已是晚期,因而预后很差。尽管近年来传统的治疗方式不断完善,但其五年生存率并未得到明显提高,因此,寻找新的治疗方法对卵巢癌而言意义重大。1971年,Folkman博士首次阐述了血管生成与实体肿瘤之间的关系,自此之后,血管生成以及抗血管生成治疗便一直是肿瘤研究领域的热点。现已证明,与所有的实体肿瘤相同,卵巢癌的生长转移亦与新生血管的生成密切相关。因此,靶向抗血管治疗可望为卵巢癌的治疗带来新的希望。虽然目前有很多的血管生成抑制剂进入临床并取得了明显疗效,但蛋白质药物本身的半衰期短、稳定性差以及价格昂贵等缺点却不容忽视。抗血管生成基因治疗可以很大程度上解决这一问题,也因此受到越来越多的关注。人核糖核酸酶抑制因子（human ribonuclease inhibitor,hRI）是一种分子量为50KD的胞浆酸性糖蛋白,广泛存在于哺乳动物的各种组织器官中,尤以人胎盘中含量最为丰富。RI可与RNase A以1:1化学计量比紧密结合,对其产生竞争性抑制作用,进而调节胞浆中的RNA水平。血管生成因子（angiogenin,Ang）是一种具有促进新生血管生成活性的蛋白质,在许多肿瘤组织中存在着表达升高的现象。它属于RNase超家族中的一员,与RNase A有35%的序列同源性。研究表明,RI与Ang具有更强大的结合力,与RI结合后的Ang便失去了其诱导血管生成的活性,从而导致肿瘤的生长减慢。因此,RI可通过抑制肿瘤中新生血管的生成来抑制肿瘤的生长,是一种很有潜力的抗肿瘤药物。本实验则是应用基因转染的方法建立稳定表达RI基因的卵巢癌SKOV3细胞系,并观察其对细胞生长的影响,从而为将来RI基因在卵巢癌治疗中的研究提供细胞模型及实验依据。目的:建立稳定表达RI基因的卵巢癌SKOV3细胞系,并观察外源基因对细胞体外增殖的作用.方法:以脂质体为介导,将携有RI基因的重组载体pLNCX-ri转染SKOV3细胞,实验分三组,RI基因转染组（SKOV3/RI组）、空载体转染组（SKOV3/Neo组）和空白对照组（SKOV3组）。采用G-418筛选获得稳定转染的细胞系后,通过RT-PCR技术和免疫细胞化学染色方法鉴定各组细胞中RI基因的表达;通过MTT、细胞周期分析、细胞凋亡检测方法观察该基因对细胞生长的影响。结果:外源性RI基因已整合于细胞基因组中,并获得稳定表达。转染RI基因后的细胞生长速度减慢,明显低于对照组,有显著性差异（P<0.01）。细胞周期分析显示,实验组G1期细胞增至69.23%,S期细胞降至24.34%,与另外两组相比差异有显著性（P<0.01）,说明其DNA合成受到抑制,绝大多数细胞停滞于G1期。细胞凋亡检测表明SKOV3/RI组细胞凋亡率为58.25% ,与SKOV3组（17.97%）及SKOV3/Neo组（21.42%）比较,有显著性差异（P<0.01）,而后两组没有统计性差别（P>0.05）。结论:通过脂质体介导,可以建立RI基因稳定表达的卵巢癌细胞系,且RI基因对SKOV3细胞的体外增殖有抑制作用。

论文目录

• 一、正文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料与方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 综述
• （二） 参考文献
• 三、致谢