论文摘要
目的:糖尿病性心肌病（diabetic cardiomyopathy,DC）是糖尿病性心脏病的特异性病变。已有较多证据表明,部分糖尿病（diabetes mellitus,DM）患者出现的心力衰竭与大血管的粥样硬化无关,而是由糖尿病心肌病所致。早期因无症状或症状不典型,DC的诊断和治疗常被忽视。因此,阐明DC的发病机制,早期干预延缓DC的发生发展,对降低DM患者死亡率有重要意义。目前,糖尿病心肌病的发病机制尚不清楚,涉及代谢紊乱、组织结构异常、局部病理生理改变等多个方面。近年有学者提出“氧化应激学说”,认为高糖作用于心肌线粒体,激活活性氧簇,由于活性氧的过度生成使细胞的抗氧化防御系统不能完全消除有毒自由基或失去其防御功能,导致内环境稳态失衡,诱生型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）表达增多,诱导产生大量的一氧化氮（NO）,活化的炎细胞释放超氧阴离子（?）。NO可与（?）迅速结合生成氧化作用更强的过氧化亚硝酸阴离子（ONOO-）,ONOO-可使蛋白质酪氨酸残基或游离酪氨酸发生硝基化反应,形成最终产物硝基酪氨酸（nitrotyrosine,NT）。蛋白质的硝基化可导致酶活性的丧失、细胞的坏死和凋亡,从而参与了糖尿病并发症的发生及进展过程。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC）为二硫氨基酸酯,因其分子所含巯基（thiol）结构,具有抗氧化及金属螯合作用。可以特异性抑制核转录因子-κB（nuclear factor-κB,NF-κB）的活性,有效抑制氧化损伤过程中因NF-κB活性增高引起的多种炎症介质的表达。已有多项研究表明,PDTC可降低糖尿病大鼠血糖水平。本研究以高脂喂养加小剂量链脲佐菌素（streptozotocin,STZ）腹腔注射建立的2型糖尿病大鼠模型为研究对象,观察氧化应激对糖尿病心肌病发生的影响及PDTC对糖尿病大鼠心肌的保护作用。为开发防治糖尿病及其并发症的新药提供实验依据。方法:参照Reed等方法建立2型糖尿病大鼠模型。健康8周龄雄性Wistar大鼠37只,体重180-210g。随机分为正常对照组（NC组）12只和高脂饮食组（HFD组）25只,NC组喂以标准大鼠饲料,HFD组喂以高脂饲料,喂养8周后行口服葡萄糖耐量试验,HFD组证实出现胰岛素抵抗后,一次性腹腔注射链脲佐菌素27mg/kg,NC组注射同等剂量柠檬酸钠缓冲液,两组大鼠以原饲料继续喂养。72h后测定血糖值,以随机血糖≥16.7mmol/L者为2型糖尿病大鼠造模成功,共成模24只。将成模大鼠随机分为糖尿病组（DM组）和PDTC治疗组（PDTC组）。PDTC治疗组腹腔注射PDTC 50mg/kg/d,NC组和DM组每日注射同等剂量的的生理盐水。各组大鼠每周监测血糖和体重。每组大鼠于注射STZ前做口服葡萄糖耐量试验（OGTT）。大鼠自采血前一日20:00PM起禁食,实验日8:00AM分别从内眦静脉取血3ml,分离血清,用于血糖、胰岛素及血脂水平的检测。PDTC治疗1周后,断头处死动物,分别留取大鼠心肌组织用于超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase,GSH-Px）活力、丙二醛（malondialdehyde,MDA）含量、心肌细胞凋亡率、iNOS、NF-κB蛋白含量的测定及心肌细胞形态学观察。1血糖、胰岛素的测定血糖采用葡萄糖氧化酶法测定。胰岛素采用ELISA法测定。应用稳态模型胰岛素抵抗指数（homeoestasis model assessment of insulin resistance,HOMA-IR）及胰岛素敏感指数（insulin sensitivity index,ISI）评价胰岛素抵抗的程度。HOMA-IR=（FBG×FINS）/22.5表示胰岛素抵抗的程度;ISI=1/（FBG×FINS）,表示胰岛素敏感性,均使用自然对数表示。2口服葡萄糖耐量试验（OGTT）OGTT以2g/kg葡萄糖灌胃,分别测定0min、30min、60min、90min、120min血糖及胰岛素水平。3血脂的测定用全自动生化分析仪测定甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）的水平,采用Cu2+比色法测定游离脂肪酸（FFA）的水平。4心肌组织SOD、GSH-Px活力和MDA含量的测定取心肌组织200mg,制备10%组织匀浆,4℃3000r/min离心15min,留上清,严格按照试剂盒说明分别测定SOD、GSH-Px的活力及MDA的含量。5心肌细胞形态学观察各组大鼠心肌组织经10%中性福尔马林溶液固定24小时后,石蜡包埋后制备组织切片,行HE及iNOS、NT免疫组化染色;大鼠心肌经4%戊二醛溶液固定24小时后,制备电镜组织切片,透射电镜下观察心肌细胞超微结构的变化。6心肌细胞凋亡率测定经70%乙醇固定的心肌组织,制备单细胞悬液,用碘化丙啶（propidium iodide,PI）一步染色法,4℃染色30 min,流式细胞仪（FCM）测定凋亡细胞百分率。7心肌组织iNOS、NF-κB蛋白含量测定提取心肌组织细胞浆蛋白与核蛋白,经Western-blot检测心肌组织中iNOS、NF-κB的相对表达量。8统计学处理所有数据均用SPSS13.0软件处理。计量资料以x±s表示,两组间差异用两样本均数的t检验进行比较;多组间比较采用单因素方差分析。检验标准α=0.05,P<0.05有统计学差异。结果:1注射STZ前两组大鼠的比较1.1两组体重的比较实验开始时,大鼠随机分为正常对照组（NC组）和高脂饮食组（HFD组）,两组大鼠体重无统计学差异。喂养8周后,HFD组大鼠体重（361.92±19.22g）明显高于NC组（313.17±19.95g）（P<0.01）。1.2两组大鼠空腹血糖、空腹胰岛素、HOMA-IR和ISI的比较大鼠喂养8周后,HFD组与NC组空腹血糖无统计学差异;HFD组空腹胰岛素水平（18.01±2.63μIU/ml）明显高于NC组（10.67±0.83μIU/ml）（P<0.05）;HFD组HOMA-IR（1.22±0.17）明显高于NC组（0.68±0.09）（P<0.05）;HFD组ISI（-4.43±0.17）明显低于NC组（-3.79±0.09）（P<0.05）。1.3两组大鼠血脂的比较大鼠喂养8周后,HFD组大鼠TC（8.79±1.83mmol/L）明显高于NC组（2.18±0.11mmol/L）（P<0.05）;HFD组大鼠TG（1.12±0.31mmol/L）明显高于NC组（0.66±0.07mmol/L）（P<0.05）;HFD组大鼠LDL（1.72±0.28mmol/L）明显高于NC组（1.10±0.07mmol/L）（P<0.05）;HFD组大鼠FFA（1.82±0.14mEq/L）明显高于NC组（1.27±0.13mEq/L）（P<0.05）。1.4两组大鼠OGTT的比较大鼠喂养8周后,行OGTT结果显示:HFD组大鼠各时间点血糖水平均较NC组明显升高,其中90min、120min两个时间点血糖水平比较有显著性差异（P<0.05）;HFD组大鼠各时间点胰岛素水平较NC组明显升高（P<0.05）。2注射STZ后各组大鼠指标比较2.1各组大鼠空腹血糖的比较8周末, HFD组注射STZ 72h后, HFD组大鼠空腹血糖（26.16±3.38mmol/L）明显高于NC组（4.41±0.56mmol/L）（P<0.01）。24只HFD组大鼠随机血糖≥16.7mmol/L,确定为2型糖尿病大鼠。PDTC治疗1周后大鼠空腹血糖（ 11.55±2.89mmol/L ）明显低于DM（26.55±2.90mmol/L）组（P<0.01）。2.2各组大鼠心肌组织SOD、GSH-Px活力及MDA含量的比较DM组大鼠心肌组织SOD、GSH-Px的活力明显低于NC组（P<0.05）,PDTC治疗组大鼠的SOD、GSH-Px活力明显高于DM组（P<0.05）;DM组大鼠心肌组织的MDA含量明显高于NC组（P<0.05）,PDTC治疗后大鼠心肌的MDA含量明显低于DM组（P<0.05）。2.3各组大鼠心肌组织形态学变化2.3.1 HE染色观察各组大鼠心肌形态学变化NC组心肌细胞排列整齐,细胞核大小均一,胞浆染色均匀;DM组心肌纤维排列紊乱,心肌细胞变性坏死,心肌细胞间脂肪细胞、炎细胞浸润;PDTC组较DM组病变减轻。2.3.2免疫组化观察各组大鼠心肌中iNOS、NT的表达iNOS和NT在DM组大鼠心肌表达水平均明显高于NC组;PDTC治疗后大鼠心肌组织中iNOS和NT的表达均明显低于DM组。2.3.3各组大鼠心肌超微结构改变透射电镜观察心肌超微结构发现,NC组:肌节对位整齐,线粒体结构完好;DM组:部分肌节错位,线粒体有嵴和膜的损伤,线粒体髓样化,内质网扩张,糖原颗粒堆积,有脂滴;PDTC治疗组:肌节对位基本整齐,线粒体内只见很少数嵴溶解,肌浆网扩张有改善。2.4心肌细胞凋亡率测定DM组大鼠心肌细胞凋亡率（25.88±1.63%）明显高于NC组（18.75±3.47%）（P<0.01）;PDTC治疗组大鼠心肌细胞凋亡率明显低于DM组（20.99±4.01%）（P<0.05）。2.5心肌组织中iNOS、NF-κB蛋白含量测定DM组iNOS的蛋白含量明显高于NC组,有显著性差异（P<0.05）;PDTC治疗组iNOS的蛋白含量明显低于DM组,有显著性差异（P<0.05）。各组总的NF-κB的含量无明显差别。DM组胞核NF-κB的蛋白含量明显高于NC组,有显著性差异（P<0.05）;PDTC治疗组NF-κB的蛋白含量明显低于DM组,有显著性差异（P<0.05）。结论:1通过高脂饮食可造成大鼠对胰岛敏感性降低,再给予小剂量链脲佐菌素腹腔注射,可成功制备2型糖尿病大鼠模型。2高糖条件下诱发氧化应激,氧化与抗氧化系统失衡,心肌细胞NF-κB活性增高,iNOS表达及NT生成增多,心肌细胞凋亡增多,表明氧化应激损伤在糖尿病心肌病的发生中起重要作用。3 PDTC不仅具有降血糖作用,并且对糖尿病心肌病变具有保护作用。早期应用PDTC可预防2型糖尿病因氧化应激所致的心肌损伤。
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