论文摘要
本研究目的在于揭示TGF-β1对奶牛乳腺细胞凋亡的影响及其机理,以阐明TGF-β1与奶牛退化期乳腺细胞凋亡的关系。实验首先构建奶牛乳腺组织培养体系,对组织、细胞进行TGF-β1处理,研究TGF-β1对乳腺细胞凋亡的影响及作用机理。1奶牛乳腺组织体外培养方法的建立采用组织灌流和组织块贴壁法体外培养奶牛乳腺组织,通过LDH活力测定、台盼兰染色、琼脂糖凝胶电泳、透射电镜技术比较两种培养方法对奶牛乳腺组织活性及组织超微结构的影响,建立奶牛乳腺组织的培养体系。结果表明:以1 mL/h的速度灌流培养的奶牛乳腺组织在DMEM+10%小牛血清培养基中24～72 h内保持良好的组织活性和超微结构,贴壁培养的奶牛乳腺组织在DMEM+10%小牛血清的培养基中48～108 h内保持良好的组织活性和超微结构,两种培养方法各有优缺点。2 TGF-β1对奶牛乳腺组织活性、凋亡及HSP70蛋白表达的影响应用LDH活力测定、琼脂糖凝胶电泳、透射电镜、免疫组化和Caspase-3活性分析等技术,检测TGF-β1对奶牛乳腺组织活性、凋亡和HSP70蛋白表达的影响。结果表明:随TGF-β1作用时间的延长（1）组织细胞的活率逐渐降低,12h、24h和48h组显著低于对照组（P＜0.05）;LDH活力逐渐升高,6h、12h、24h和48h组均显著高于对照组（P＜0.05）;（2）12、24、48h组DNA发生断裂;Caspase-3活性24 h达到高峰,并显著高于对照组（P＜0.05）;上皮细胞逐渐由腺泡脱落、腺泡塌陷,但间质结构基本完整;超微结构显示48 h上皮细胞呈现染色质凝集、线粒体肿胀等明显凋亡特征,而成纤维细胞细胞致密、线粒体丰富,结构较完整;（3）3～12h组织过表达HsP70,且均显著高于对照组（P＜0.05）。结论:TGF-β1诱导奶牛乳腺组织的上皮细胞发生凋亡,并诱导组织过表达HSP70。结果提示,TGF-β1可以以促进上皮细胞凋亡的方式,促进奶牛乳腺发生退化。3 TGF-β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖、凋亡及HSP70蛋白表达的影响应用MTT、流式细胞术、LDH活力测定、琼脂糖凝胶电泳、Western bolt技术,检测TGF-β1对乳腺上皮细胞增殖、凋亡率、LDH活力、DNA完整性及HSP70的表达。结果表明:1、5、10 ng/mL的TGF-β1均能抑制乳腺上皮细胞的增殖,且随浓度增加抑制作用加大,呈现剂量依赖性,其中10 ng/mL TGF-β1组与对照组差异显著（P＜0.05）;10 ng/mLTGF-β1作用于乳腺上皮细胞24 h,随作用时间延长细胞凋亡率逐渐增加,6 h、12 h和24 h组与对照组相比差异极显著（P＜0.01）;LDH活力也不断升高,6 h、12 h和24 h组与对照组差异显著（P＜0.05）;DNA随TGF-β1作用时间的延长发生不同程度降解;TGF-β1作用2 h～6 h细胞大量表达HSP70,6 h达到高峰,而后下降,2～12 h的表达量均显著高于对照组（P＜0.05）。结论:TGF-β1可以抑制奶牛乳腺上皮细胞的增殖,具有浓度依赖性。10 ng/mLTGF-β1可以显著增加细胞凋亡率,提高细胞培养液中LDH活力,使细胞DNA发生不同程度的降解,同时HSP70蛋白随TGF-β1作用时间发生显著的表达变化。4 TGF-β1诱导奶牛乳腺上皮细胞凋亡的信号机制应用MTT、流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳、Western bolt、免疫组织化学技术,检测TGF-β1及SB-431542对乳腺上皮细胞增殖、凋亡、DNA完整性、p-Smad2/3的表达的影响。结果表明:TGF-β1作用于奶牛乳腺上皮细胞,0.5～2 h内激活Smad2/3发生磷酸化,且入核传导信号,接着促进细胞内[Ca2+]i升高,激活Caspase-3,裂解DNA,从而细胞发生了凋亡。10-2umol/L SB-431542通过抑制ALK-5的激酶活性阻滞了TGF-β1的信号通路,逆转了TGF-β1对乳腺上皮细胞的抗增殖和促凋亡作用。这些结果表明:TGF-β1通过ALK-5-Smad2/3路径诱导了奶牛乳腺上皮细胞凋亡,且TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞凋亡依赖于细胞内[Ca2+]i和Caspase-3活性。本实验主要研究了TGF-β1对奶牛乳腺细胞凋亡的影响及其作用机理,结果表明:TGF-β1可以以促进上皮细胞凋亡的方式,促进奶牛乳腺发生退化,且TGF-β1通过ALK-5-Smad2/3路径诱导了奶牛乳腺上皮细胞凋亡,TGF-β1诱导的乳腺上皮细胞凋亡依赖于细胞内[Ca2+]i和Caspase-3活性。证明TGF-β1诱导的上皮细胞凋亡是奶牛退化期乳腺细胞凋亡的重要原因。
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