论文摘要
目的:食管下括约肌（Lower esophageal sphincter,LES）主要受肠肌神经元支配,本研究探讨了支配人食管下括约肌钩状纤维（clasp fibres）和套索纤维（sling fibres）兴奋性和抑制性肠肌运动神经元的形态和分布特征。方法: 1标本制备:选取河北医科大学第四医院2006年3月到11月因高位食管中段癌行食管大部切除术患者20例,其中男10例,女10例,平均年龄53岁。将采集新鲜食管胃结合部（Esophagogastric junction, GEJ）手术标本,以下列两种方式切开,一种沿大弯侧切开以保留完整钩状纤维,另一种沿小弯侧切开以保留完整套索纤维。将标本粘膜面向上固定到附有Sylgard184胶培养皿中,用无菌Krebs液反复冲洗,并持续通以5%CO2和95% O2混合气体。将整个标本粘膜层及部分粘膜下层解剖掉,并在解剖显微镜下把钩状纤维或套索纤维上的粘膜下层全部仔细去掉。2荧光标记:将1个覆有荧光染料羰花青DiI （1,1ˊ- didodecyl 3,3,3ˊ,3ˊ-indocarbocyanine perchlorate, DiI）直径200μm玻璃珠放在钩状纤维或套索纤维上,轻压10分钟后,使玻璃珠粘附在肌纤维上,添加培养基DEM/F12 250ml到盛有标本的培养皿中,然后在37℃孵育箱孵育5天,每日更换一次培养液,使荧光性物质DiI被支配食管下括约肌肌纤维的肠肌运动神经元轴突末梢摄取,并逆行性转运到神经元胞体。5天后,把培养后的标本放入4℃调整Zamboni’s液,固定16-24小时,再用PBS液反复冲洗。3免疫组化:用显微镊将肌间神经丛上的环行肌全部撕去,制成肌间丛贴附在纵行肌上的整装标本。放入90%甘油碳酸氢盐缓冲液浸洗3天。将含10%的正常羊血清鼠抗胆碱乙酰转移酶（Choline acetyltransferase,ChAT）或兔抗一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase, NOS）稀释一抗滴加到整装标本上,在室温下于湿盒中孵育4天。用PBS液反复冲洗后,将FITC标记的羊抗鼠或羊抗兔血清加入标本中,于室温下在湿盒中孵育2天。再用PBS液反复冲洗后,将标本装入90%甘油碳酸氢盐缓冲液中,在落射荧光显微镜下观察记录被标记神经元胞体位置及免疫活性,拍摄标记清晰的神经元,并分析其形态。免疫阳性和免疫阴性神经元所占比例用mean±SEM表示,其支配优势的显著性差异采用Wilcoxon Signed Ranks Test（SPSS 12.0）。P<0.05为有显著差异。结果:1在DiI标记点上,可以看到一束被强标记的平滑肌细胞,在其正下方,有直径约1 mm荧光斑。2当标本沿大弯侧剪开时,钩状纤维得以完整保存,可以看到位于食管下段的半环形肌束。当附载DiI的玻璃珠标记在该肌纤维上时,支配该肌的运动神经元被标记。在10例标本中,总共观察到292个神经元（每例标本观察到15-45个标记神经元;平均29±3）。其中52%（SEM=5%）位于标记点的口侧,即为降行性神经元。45%（SEM=6%）位于标记点2mm范围内,即为局部神经元,只有约3%位于肛侧。在用胆碱乙酰转移酶标记的5例标本中,平均31%（SEM=1%;）具有ChAT活性, 35%（SEM=2%）的局部运动神经元具有ChAT活性,而口侧运动神经元只有25%（SEM=7%）具有ChAT活性。在用NOS标记的5例标本中,DiI标记的运动神经元中65%（SEM=2%）有NOS免疫活性（Wilcoxon Signed Ranks Test;P=0.039）,其中口侧85%（SEM=4%）有NOS免疫活性。3当标本沿食管胃结合部小弯侧剪开时,Sling纤维得以完整保存,可以看到起于食管末端增厚的不完整U形肌束。当附载DiI的玻璃珠标记在该肌纤维上时,可以观察到支配该肌的运动神经元分布。在10例标本中,观察到433（每例标本观察到21-73个标记神经元;平均43±6）个神经元。在这些细胞中,46%（SEM=2%）位于肛侧,43%（SEM=6%）位于局部。在用胆碱乙酰转移酶标记的5例标本中,平均58%（SEM=2%）具有ChAT活性（Wilcoxon Signed Ranks Test;P=0.042）,62%（SEM=2%）的局部运动神经元及66%（SEM=3%）肛侧神经元具有ChAT活性。在用NOS标记的5例标本中,DiI标记的运动神经元中36%（SEM=2%）有NOS免疫活性。其中口侧64%（SEM=10%）有NOS免疫活性。4在标记的神经元中,DiI可以显示神经元胞体,而神经核很少被DiI染色。在一些被充分标记的神经元中,树突和轴突也可以看到。所有被充分标记的细胞有单一轴突和许多细丝状树突,符合Dogiel I型细胞特征。结论:1 DiI标记的运动神经远主要有胆碱乙酰基转移酶或一氧化氮合酶活性,分别被认为是兴奋运动神经元和抑制性运动神经元。2支配钩状纤维的运动神经元主要位于局部和口腔侧,抑制性神经元占多数,大部分降行性神经原为抑制性的,局部约有一半运动神经元有NOS免疫活性,而兴奋性运动神经元主要位于食管下括约肌局部。3支配套索纤维运动神经元主要位于局部和肛侧,兴奋性神经元占多数,主要位于局部和肛侧,而抑制性神经元主要位于局部和口侧。4支配食管下括约肌的神经元具有Dogiel I型细胞特征,即有单一轴突和许多叶状或层状树突,但无论从形态还是细胞大小以及树突数目,均有很大变异。
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