TGEV S基因、N基因双顺反子DNA疫苗的构建研究

论文摘要

猪传染性胃肠炎（TGE）是由猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起的一种危害我国养猪业的重要肠道传染病,该病毒的N、S蛋白可诱导机体产生特异性抗体。应用双启动子表达载体制备多价核酸疫苗在基因免疫的研究中具有重要意义,通过构建双表达载体的方法将TGEV的S和N基因联合应用是一种有效且简便易行的方法。本研究以pVAX1为基础构建了通用的双启动子表达载体pVAXD;将TGEVS基因主要抗原位点片断Sa和N基因同时插入pVAXD,构建了真核双顺反子表达载体pVAXD-N-Sa,对其免疫原性进行了初步研究。1.真核双启动子表达载体pVAXD的构建通过对载体pVAX1多克隆位点的改造,分别构建出pVAXA和pVAXB。用PCR方法从载体pVAXA上扩增含-PCMV-MCS-BGHpolyA-的表达单元片段,插入pVAXB,组装成双启动子表达载体pVAXD。在pVAXD中分别插入DsRed和EGFP基因,构建单表达质粒pVAXD-DsRed和pVAXD-EGFP,再在pVAXD-DsRed中插入EGFP基因构建双表达质粒pVAXD-EGFP-DsRed。将以上重组质粒转染COS-7细胞进行瞬时表达,用荧光显微镜观察,结果双表达质粒与单表达质粒相比同一种荧光蛋白表达强度无明显差异,且双表达质粒pVAXD-EGFP-DsRed中两种荧光蛋白间表达强度相当。结果表明载体pVAXD构建成功,能够同时表达两个外源基因。本实验构建的双启动子载体为进行基因表达的研究提供了新的工具,并为双价DNA疫苗的研制和提高核酸疫苗免疫效率的研究奠定基础。2.TGEV双顺反子核酸疫苗pVAXD-N-Sa的构建分别从pMD19T-Sa、pMD19T-N上扩增S基因主要抗原位点片断Sa和N基因。将TGEV Sa片断和N基因分别插入载体pVAXD中,构建出单表达质粒pVAXD-Sa和pVAXD-N。在pVAXD-Sa上插入N基因构建出双表达质粒pVAXD-N-Sa。将重组质粒分别转染COS-7细胞进行表达,通过RT-PCR法检测表达情况。结果pVAXD-Sa和pVAXD-N组能分别扩增出约2.1kb和1.2kb的条带,而pVAXD-N-Sa组能同时扩增出1.2kb和2.1kb的两条带,从而从mRNA水平证实在载体pVAXD-N-Sa中N基因和Sa片断得到了共表达,初步实现了N和Sa的体外共表达。3.TGEV双顺反子核酸疫苗pVAXD-N-Sa免疫原性的初步研究将重组质粒pVAXD-Sa、pVAXD-N、pVAXD-N-Sa以及混合质粒pVAXD-N+pVAXD-Sa免疫小鼠,用ELISA方法检测小鼠抗体水平变化。pVAXD-Sa、pVAXD-N-Sa、pVAXD-Sa+pVAXD-N组在首免后第14d可检测到抗TGEV阳性抗体,并且在第35d出现高峰。pVAXD-N在首免后第28天检测到抗TGEV阳性抗体,在第42d出现高峰。同时还发现pVAXD-N-Sa和pVAXD-Sa+pVAXD-N免疫组诱导的ELISA抗体水平高于pVAXD-Sa和pVAXD-N免疫组,而双表达组与混合质粒组间无明显差异。结果表明,重组真核表达载体中的抗原基因在鼠体内得到了表达,表达的抗原蛋白诱导鼠产生了体液免疫应答,并且N和Sa联合作用的免疫效果优于单独免疫。本研究为TGEV双价DNA疫苗的研制奠定基础,对TGEV的防制具有重要意义。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1.文献综述
• 1.1 猪传染性胃肠炎病毒研究进展
• 1.1.1 TGEV的病原特征
• 1.1.2 TGEV的生物学特征
• 1.1.3 TGEV的分子生物学特征
• 1.1.4 TGEV的疫苗研究现状
• 1.2 多基因共表达载体研究进展
• 1.2.1 多基因共表达载体的概念
• 1.2.2 多基因表达载体的主要类型与构建方法
• 1.2.3 多基因表达载体的应用进展
• 2 研究目的和意义
• 3 材料与方法
• 3.1 材料
• 3.1.1 细胞、菌株与质粒
• 3.1.2 酶和主要试剂
• 3.1.3 实验动物
• 3.1.4 主要仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 重组质粒pVAXA和pVAXB的构建
• 3.2.2 双启动子载体pVAXD的构建
• 3.2.3 重组质粒pVAXD-DsRed、pVAXD-EGFP和pVAXD-EGFP-DsRed的构建
• 3.2.4 体外瞬时表达检测
• 3.2.5 pVAXD-Sa的构建
• 3.2.6 pVAXD-N的构建
• 3.2.7 双表达载体pVAXD-N-Sa的构建
• 3.2.8 重组质粒pVAXD-Sa、pVAXD-N及pVAXD-N-Sa的表达
• 3.2.9 重组质粒对小鼠免疫原性的研究
• 4 结果
• 4.1 重组质粒pVAXA和pVAXB的构建
• 4.2 双启动子载体pVAXD的构建
• 4.3 pVAXD-DsRed、pVAXD-EGFP和pVAXD-EGFP-DsRed的构建
• 4.4 体外瞬时表达检测
• 4.5 pVAXD-Sa的构建
• 4.6 pVAXD-N的构建
• 4.7 双表达载体pVAXD-N-Sa的构建
• 4.8 pVAXD-Sa、pVAXD-N及pVAXD-N-Sa的表达
• 4.9 免疫小鼠,抗体检测
• 5 讨论
• 6 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录