油菜种子含油量相关基因PEPC和DGAT的克隆及遗传转化研究

论文摘要

油菜是世界范围内广泛种植的油料作物，是世界食用植物油和植物蛋白的重要来源，近十年来其种植面积不断扩大，目前已成为世界第二大植物油来源，在国际农产品贸易中占有重要的地位。植物油是栽培油菜的主要农产品，它不仅是人和动物必须脂肪酸的主要来源，也是生产油漆、润滑剂、化装品、尼龙等化工产品的重要原料。与加拿大等国家相比，我国多数油菜品种的含油量偏低，尤其是长江流域冬油菜主产区的菜籽含油量比加拿大的低2～3个百分点，因此，高含油量油菜育种品质育种具有十分重要的现实意义。。植物油的含量与丙酮酸羧化酶（PEPC）和二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT；EC2．3．1．20）密切相关。丙酮酸羧化酶（PEPC）控制油脂、蛋白质生物合成的共同底物磷酸烯醇式丙酮的流向，从而决定植物种子蛋白质／油脂含量比例：二脂酰甘油酰基转移酶（DGAT；EC 2．3．1．20）是催化三脂酰甘油（TAG）合成的最后也是最关键的限速酶，对植物种子中的油脂含量具有十分重要的调控作用。为了提高油菜种子中的含油量，本研究从拟南芥及油菜中分别克隆DGAT基因及PEPC基因片断，构建DGAT及反义PEPC种子特异性表达载体，通过农杆菌共转化的方式将DGAT及反义PEPC基因导入油菜，使其在同一株植物中表达。一方面抑制种子中PEPC基因的表达，使其底物（丙酮酸）更多地朝生成油脂的方向流动，另一方面加快油脂合成速度，减少反馈抑制，以望获得高含油量的转基因油菜。主要结果如下：1 DGAT基因的克隆及其种子特异性植物表达载体的构建用同一对引物从拟南芥花柱基因组和总RNA中扩增了DGAT全长编码基因，并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序。测序结果表明：拟南芥DGAT基因的DNA长3020 bp，cDNA长1563bp。对测序结果进行比较发现，该基因由16个外显子和15个内含子组成，编码520个氨基酸蛋白，推测其分子量为59.0kDa，等电点pI=8.53。将拟南芥DGAT酶蛋白序列与油菜、大豆、烟草、水稻的DGAT酶蛋白序列比较，发现它们同源性较高，分别为89％、73％、69％、66％，而与动物（鼠）的同源性较低，只有38％的同源性。同Kenndy途径中的3-磷酸甘油酰基转移酶（G3PAT）、溶血性磷脂酸酰基转移酶（LPAAT）比较，发现没有很大的相似性，表明它们并不相关。用扩增引物上设计的BamHI酶切位点将DGAT基因切下，插入到pBI121.N质粒的Napin启动子BamHI酶之后，构建种子特异性表达载体，经过平PCR和限制酶切的方法筛选到DGAT正义表达载体，将DGAT cDNA重组正义表达载体命名为pBI121．ND1，DGAT DNA重组正义表达载体命名为pBI121．ND2，通过冻融法将其转化农杆菌LBA4404，并经菌落PCR验证。2．PEPC基因片段的克隆和种子特异性反义PEPC基因植物表达载体的构建利用PCR技术从甘蓝型油菜湘油15号基因组中扩增了PEPC基因片段，并将其克隆到pGEM-T Easy载体上进行测序。测序结果表明：扩增片段长576bp，与Yanai报道的PEPC基因相应区域的同源性为95％。用扩增引物上设计的BamHI和SacI两位点酶将PEP基因片段切下，反向插入到pBI121．N质粒的Napin启动子之后，构建了种子特异性反义PEPC表达载体pBI121．NP。通过冻融法将pBI121．NP转化农杆菌LBA4404，并经菌落PCR验证。3．甘蓝型油菜的遗传转化和转基因植株的获得对甘蓝型油菜子叶节再生体系和遗传转化体系进行了优化，通过农杆菌共转化的方式，将DGAT cDNA种子特异性正义表达载体及PEPC反义表达载体基因转化到湘油15号，获得了抗卡那霉素油菜转基因苗，经PCR检测和Southern杂交分析，DGAT或反义PEPC基因整合到湘油15基因组中植株共11株，其中2株同时转入PEP和DGAT基因，5株只转入PEPC单基因的，4株只转入DGAT单基因。4．转PEPC及DGAT基因在油菜中的表达及对种子内油脂和蛋白质代谢的影响研究发现DGAT在转基因植株中均能表达，在油菜种子中表达水平高，在叶中以低水平表达。转反义PEPC基因的植株种子中的PEPC活性下降，最多的可下降21.5％。11株转基因油菜种子中的油脂含量及种子重量普遍增加，其中油脂含量增加0.7～6.9个百分点，代表总净量增加1.7～17.4％，以同时转入PEPC和DGAT两个基因植株油脂含量增幅效果好；而蛋白质的含量则有不同程度的降低，下降幅度为5～11％左右，相关分析表明：种子中的蛋白质含量与油脂含量呈显著的负相关，相关系数为—0.8801。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 缩写词表
• 第一章 植物油脂代谢及其基因工程调控方法
• 第一节 植物油脂生物合成的基本途径
• 第二节 油脂生物合成的酶的鉴定及其基因
• 第三节 与含油量相关的酶DGAT及PEPC研究进展
• 第四节 植物油脂基因工程调控的方法
• 第二章 本研究的立题依据及技术路线
• 1.本研究的立题依据
• 2.总体思路与技术路线
• 第三章 拟南芥DGAT基因的克隆及表达载体的构建
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 拟南芥DNA及RNA的提取
• 1.2.2 拟南芥DGAT基因的扩增
• 1.2.3 拟南芥DGAT基因的克隆及检测
• 1.2.4 测序
• 1.2.5 拟南芥DGAT基因表达载体的构建
• 1.2.6 拟南芥DGAT基因表达载体转化根癌农杆菌
• 2.结果与分析
• 2.1 拟南芥RNA和DNA的纯度和完整性检测
• 2.2 拟南芥DGAT基因的PCR扩增及克隆
• 2.3 拟南芥DGAT基因序列及基因结构
• 2.4 拟南芥DGAT基因序列及编码的蛋白质特性
• 2.5 拟南芥DGAT酶蛋白的同源性分析
• 2.6 种子特异性DGAT基因表达载体的构建
• 2.7 DGAT种子特异性表达载体的检测及方向鉴定
• 2.8 根癌农杆菌的转化
• 3 讨论
• 3.1 关于拟南芥花柱RNA及DNA的提取
• 3.2 关于DGAT的结构及功能
• 第四章 甘蓝型油菜PEPC基因片段的克隆和种子特异性反义表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 油菜DNA的提取
• 1.2.2 PEPC基因的PCR扩增
• 1.2.3 PEPC基因的克隆
• 1.2.4 重组子的筛选鉴定
• 1.2.5 测序
• 1.2.6 反义PEPC植物表达载体的构建
• 1.2.7 反义PEPC表达载体转化根癌农杆菌菌落PCR
• 2 结果与分析
• 2.1 甘蓝型油菜PEPC片段扩增
• 2.2 重组克隆的PCR及酶切鉴定
• 2.3 PEPC片段的序列分析测序结果
• 2.4 种子特异性反义PEPC表达载体pBI121.NP构建
• 2.5 种子特异性反义PEPC表达载体pBI121.NP构建的检测
• 2.6 根癌农杆菌的转化
• 3 讨论
• 第五章 油菜的遗传转化及转基因油菜的获得
• 1 材料和方法
• 1.1 实验材料
• 1.1.1 植物品种
• 1.1.2 质粒与菌种
• 1.1.3 酶与试剂
• 1.1.4 培养基
• 2 实验方法
• 2.1 外植体制备
• 2.2 卡那霉素临界值的确定
• 2.3 农杆菌的培养
• 2.4 菌液浓度及浸染时间的确定
• 2.5 共培养时间对转化的确定
• 2.6 延迟筛选对遗传转化的影响
• 2.7 抗性芽的梯度筛选
• 2.8 转基因油菜的分子生物的检测
• 3 结果与分析
• 3.1 卡那霉素临界值的确定
• 3.2 苗龄及预培养对子叶节遗传转化的影响
• 3.3 农杆菌菌液浓度及感染时间对转化的影响
• 3.4 共培养时间对转化的影响
• 3.5 延迟筛选对遗传转化的影响
• 3.6 抗性芽的梯度筛选与植株再生
• 3.7 稳定转化及抗性植株的获得
• 3.8 抗卡那霉素转基因绿苗的获得
• 3.9 转基因油菜的PCR分析
• 3.10 转基因油菜PCR-Southern杂交检测
• 4.讨论
• 4.1 关于甘蓝型油菜子叶节农杆菌介导法高效转化体系的建立
• 4.2 关于多基因的遗传转化
• 4.3 阳性植株PCR检测引物设计和PCR-Southern杂交探针选择
• 第六章 转PEPC及DGAT基因在油菜中的表达及对种子内油脂和蛋白质代谢的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 转基因油菜的半定量一步PCR分析
• 1.2.2 Northern杂交
• 1.2.3 PEP酶活性的测定
• 1.2.4 种子内总蛋白的提取与含量测定
• 1.2.5 含油量的测定
• 2.实验结果
• 2.1 转DGAT基因植株中DGAT基因的转录水平
• 2.2 转DGAT基因在油菜叶与种子的中的表达状况
• 2.3.转反义PEP基因对PEP酶活性影响
• 2.4 转基因植株种子中蛋白质和油脂的变化及关系
• 2.5 转基因对植株的种子重量影响
• 3.讨论
• 3.1 PEP的表达及对油菜种子中油脂蛋白质含量的影响
• 3.2 DGAT基因的表达对油菜种子中油脂蛋白质含量的影响
• 3.3 DGAT和PEP基因的共同表达对油菜种子中油脂蛋白质含量的影响
• 3.4 关于本研究中转基因植物安全性问题的讨论
• 参考文献
• 博士期间论文发表情况
• 致谢