柠条锦鸡儿苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因的克隆、RNAi载体构建和相关功能分析

论文摘要

柠条锦鸡儿抗干旱、高温、寒冷,耐盐碱和贫瘠土壤,是我国西部等环境极端地区的重要栽培灌木品种和重要的饲料、制浆树种。但柠条的木质素含量较高,降低了柠条的饲用价值,增加了柠条纸浆开发的成本。因此进行柠条木质素生物合成调控方面的研究意义重大。 本论文以柠条锦鸡儿为实验材料,以木质素合成关键酶PAL为对象,进行了酶的纯化、酶活性的时空差异、编码基因的时空表达、编码基因片段的克隆、RNAi载体构建及RNAi序列对靶酶的调控效应等方面的研究工作。 实验结果表明:柠条干种子中存在微弱的PAL活性,当种子开始萌动后PAL活性迅速增加,活性比干种子增加近4倍,比活增加5倍多。从萌芽期到硬化期,在实验样品的根、茎、叶及相应器官中PAL活性和比活均呈现出小—大—小的类抛物线变化。叶器官中PAL活性从子叶期到速生期迅速增加,真叶期比子叶期增加2.2倍,速生期达到最大,比真叶期增加1.33倍。而硬化期活性降低,硬化期比速生期活性降低21%;茎中PAL活性从子叶期到速生期迅速增加,真叶期比子叶期增加1.48倍,速生期达到最大,比真叶期增加1.25倍。硬化期时活性大大降低,仅为速生期活性的48%;而根中PAL活性在真叶期达到最大,真叶期后活性降低,速生期、硬化期的活性分别为真叶期活性的49%和17%。各器官中PAL比活变化与活性变化基本相似。 速生期叶片中的PAL,经DEAE52离子交换层析分离,可以得到2个活性峰,分别在盐离子浓度约为0.4M和0.75M时出现。速生期茎中和真叶期根中的PAL,经DE52离子交换层析分离,均得到1个活性峰,在盐离子浓度约为0.4M时出现。分子筛层析表明:DEAE52中分离到的活性峰均为单一活性峰组分,0.4M盐离子洗脱峰分子量约为222KD;0.75M盐离子洗脱峰分子量约为306KD。SDS-PAGE结果表明:分子量为222KD的PAL全酶是由单一亚基组成的多聚体,亚基分子量为74KD;分子量为306KD的PAL全酶是由2种亚基组成的多聚体,亚基分子量分别为74KD和82KD。 以18SrRNA片段为内标探针,进行的半定量Northern杂交表明:柠条的不同器官和不同发育阶段,pal有不同的表达量。柠条存在2类pal编码基因,碱基数较少的b基因存在于所有样本中,而碱基数较多的a基因仅存在于叶片中。根部器官中palb基因的表达以子叶期为最高,分别约为真叶期、速生期和硬化期的1.24、1.94和5.17倍。茎中该基因以真叶期为最高,分别约为子叶期、速生期和硬化期的2.85、4.61和5.11倍。叶中该基因以真叶期为最高,分别约为子叶期、速生期和硬化期的2.69、3.56和4.48倍。仅存在于柠条叶中的pal a基因表达量变化趋势与b基因相似,以真叶期为最高,分别是子叶期、速生期和硬化期的2.82、1.93和2.38倍;但（1）a基因表达量差异比器官中b基因间的差异小;（2）a基因的表达量比同期b基因的表达量低,a基因的表达量与同期pal总表达量的比值随发育而升高。 对用TRIZOL法提取的真叶期、速生期、硬化期茎的RNA,进行了质量分析,结果表明:所提RNA样品中OD260/OD280均超过1.9;在电泳条带上28S/18S均超过2。 根据以DNA为模板扩增出的pal序列设计一对特异引物,以pal表达量最高的真叶期茎RNA为模板,利用RT-PCR进行扩增。扩增片段回收后连接到pGEM-T—Easy载体中,对T载体中插入的pal片段测序,对序列进行读码分析,登陆NCBI进行同源性比对,用DNAMAN软件与DNA为模

论文目录

• 第一章 绪论
• 1.1 木质素调控研究进展
• 1.1.1 木质素概论
• 1.1.2 木质素的生物合成
• 1.1.2.1 木质素单体的生物合成
• 1.1.2.2 木质素单体的聚合
• 1.1.2.3 木质素单体合成途径的多样性
• 1.1.3 木质素生物合成调控的研究进展
• 1.1.4 木质素基因工程
• 1.1.4.1 苯丙烷途径的生物调控
• 1.1.4.2 木质素单体特异合成相关酶的生物调控
• 1.1.4.3 木质素特异合成途径下游酶类的生物调控
• 1.2 植物基因克隆的方法与策略
• 1.2.1 图位克隆技术（map-based cloning or positional cloning）
• 1.2.2 转座子或T-DNA标签法（transposon or T-DNA tagging method）
• 1.2.3 同源序列法（homofogy based candidate gene method）
• 1.2.4 表达序列标签法（expressed sequenee tagging method，EST）
• 1.2.5 差异表达基因的分离方法（differentially expressed gene cloning methods）
• 1.2.5.1 代表性差示分析法（RDA）
• 1.2.5.2 抑制性差减杂交PCR法（SSH）
• 1.2.5.3 交互差减差异 RNA显示（RSDD）
• 1.3 苯丙氨酸解氨酶（PAL）的研究进展
• 1.3.1 PAL的存在和分布
• 1.3.2 PAL的酶学性质
• 1.3.3 PAL对植物生理代谢的意义
• 1.3.3.1 在细胞分化和木质化中的作用
• 1.3.3.2 在植物色素形成过程中的作用
• 1.3.3.3 在植物的根瘤形成过程中的作用
• 1.3.3.4 PAL在植物抗逆境中的作用
• 1.3.3.5 植物PAL基因的克隆与PAL活性的调控
• 1.4 RNA干扰研究进展
• 1.4.1 RNAi的定义
• 1.4.2 RNAi的作用机制
• 1.4.3 RNAi的特点
• 1.4.3.1 RNAi的结构特征
• 1.4.3.2 RNAi的特异性
• 1.4.3.3 RNAi的高效性
• 1.4.3.4 RNAi的可扩散性
• 1.4.3.5 RNAi的可遗传性
• 1.4.4 产生RNAi的方法
• 1.4.5 RNAi技术在植物生物学中的应用
• 1.4.5.1 植物基因功能的研究
• 1.4.5.2 植物品质改良
• 1.4.5.3 植物转录后基因沉默（RTGS）诱导抗性
• 1.4.5.4 展望
• 1.5 柠条
• 1.5.1 柠条的生态学特征
• 1.5.2 柠条对环境的适应性
• 1.5.2.1 抗旱性
• 1.5.2.2 抗热性
• 1.5.2.3 抗寒性
• 1.5.2.4 耐盐碱性
• 1.5.3 柠条对生态环境的改善功能
• 1.5.4 柠条的经济价值
• 1.6 本研究的目的意义和选题依据
• 1.7 主要研究内容
• 第二章 柠条锦鸡儿 DNA的提取及 PAL基因引物的设计
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 材料培养
• 2.1.2.2 柠条DNA提取
• 2.1.2.3 柠条palDNA的PCR扩增
• 2.1.2.4 琼脂糖凝胶电泳分析
• 2.1.2.5 琼脂糖凝胶产物的回收
• 2.1.2.6 PCR片段的TA克隆
• 2.1.2.7 大肠杆菌Top10感受态细胞的制备
• 2.1.2.8 转化
• 2.1.2.9 重组质粒的筛选及鉴定
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 柠条DNA提取
• 2.2.2 PAL基因片段的扩增
• 2.2.3 重组质粒的鉴定
• 2.2.3.1 重组质粒的酶切鉴定
• 2.2.3.2 重组质粒的PCR鉴定
• 2.2.4 PAL基因片段的序列测定
• 2.3 讨论
• 第三章 柠条锦鸡儿苯丙氨酸解氨酶的活性测定以及分离纯化
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 材料培养
• 3.1.3 培养用营养液
• 3.1.4 实验材料选取
• 3.1.4.1 PAL粗酶活性测定材料
• 3.1.4.2 PAL纯化材料
• 3.1.5 PAL粗酶提取
• 3.1.6 PAL活性和比活测定
• 3.1.7 蛋白质含量测定
• 3.1.8 PAL酶蛋白纯化
• 3.1.8.1 盐析
• 3.1.8.2 离子交换层析纯化PAL
• 3.1.8.3 分子筛凝聚层析纯化PAL
• 3.1.8.4 PAL全酶分子量测定
• 3.1.9 PAL酶蛋白的电泳
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 蛋白质含量标准曲线
• 3.2.2 苗期柠条不同阶段、不同器官PAL活性和比活
• 3.2.3 柠条PAL的离子交换层析
• 3.2.4 柠条 PAL的分子筛层析及全酶分子量测定
• 3.2.4.1 蛋白质分子量标准曲线制作
• 3.2.4.2 柠条PAL的分子筛层析
• 3.2.5 纯化 PAL的SDS-PAGE鉴定及 PAL亚基分子量测定
• 3.3 讨论
• 第四章 柠条锦鸡儿发育中苯丙氨酸解氨酶基因表达的研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 材料培养
• 4.1.3 培养用营养液
• 4.1.4 实验材料选用
• 4.1.5 方法
• 4.1.5.1 柠条 RNA提取
• 4.1.5.2 RNA甲醛变性胶电泳检测
• 4.1.5.3 转膜
• 4.1.5.4 探针标记
• 4.1.5.5 样品杂交
• 4.1.5.6 显色
• 4.1.5.7 杂交信号的灰度分析
• 4.1.5.8 剥离探针
• 4.1.5.9 18SrRNA杂交
• 4.2 结果
• 4.3 讨论
• 第五章 柠条锦鸡儿苯丙氨酸解氨酶cDNA片段的克隆与序列分析
• 5.1 材料与方法
• 5.1.1 材料
• 5.1.1.1 RNA提取用样本
• 5.1.1.2 Pal基因片段克隆用样本
• 5.1.1.3 试剂
• 5.1.2 材料培养
• 5.1.3 培养用营养液
• 5.1.4 柠条 RNA的提取
• 5.1.4.3 RNA的质量检测和浓度测定
• 5.1.4.4 RNA的琼脂糖凝胶电泳
• 5.1.4.5 逆转录
• 5.1.4.6 PCR扩增
• 5.1.4.7 琼脂糖凝胶产物的回收
• 5.1.4.8 pGEM-T Easy Vector克隆
• 5.1.4.9 大肠杆菌 Top10感受态细胞的制备
• 5.1.4.10 转化
• 5.1.4.11 重组质粒的筛选及鉴定
• 5.2 结果
• 5.2.1 提取 RNA样品的浓度测定及质量鉴定
• 5.2.1.1 RNA样品的紫外吸收测定
• 5.2.1.2 RNA的电泳检测
• 5.2.3 重组质粒的鉴定
• 5.2.3.1 重组质粒的酶切鉴定
• 5.2.3.2 重组质粒的PCR鉴定
• 5.2.4 Pal基因片段的序列测定
• 5.2.4.1 Pal基因片段的序列测定
• 5.2.4.2 pal基因片段的阅读框架分析
• 5.2.4.3 扩增片段的同源性比对
• 5.3 讨论
• 第六章 RNAI表达载体构建
• 6.1 材料与方法
• 6.1.1 材料
• 6.1.2 方法
• 6.1.2.1 中间载体pBlueintron的构建
• 6.1.2.2 中间载体pBlulntronpalI的构建
• 6.1.2.3 中间载体pBlueintronpalII的构建
• 6.1.2.4 RNAi载体Pa1RNAiqf的构建
• 6.1.3 载体构建流程图
• 6.2 结果与分析
• 6.2.1 中间载体pBlueintron的构建
• 6.2.2 中间载体pBlueintronpalI的构建
• 6.2.3 中间载体pBlueintronpalII的构建
• 6.2.4 RNAi载体paiRNAiq的构建
• 6.3 讨论
• 第七章 RNA干扰表达载体的转化、农杆菌侵染及转基因植株检测鉴定
• 7.1 材料与方法
• 7.1.1 材料
• 7.1.2 方法
• 7.1.2.1 农杆菌转化
• 7.1.2.2 转目标基因烟草的PCR筛选
• 7.1.2.3 转基因烟草的Southern杂交鉴定
• 7.1.2.4 Northern杂交鉴定转palRNAiqf基因在转基因烟草中RNAi效果
• 7.2 结果和分析
• 7.2.1 酶切鉴定
• 7.2.2 转基因烟草的PCR鉴定
• 7.2.3 转基因烟草的Southern鉴定
• 7.2.4 RNA干扰载体功能测定
• 7.3 讨论
• 第八章 结论
• 附录
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历