11p15.5染色体区相关印记基因IGF-2和TSSC3在骨肉瘤中的表达及调控机制研究

论文摘要

骨肉瘤（osteosarcoma）是好发于青少年的高侵袭性的骨原发性恶性肿瘤,早期即可发生广泛的肺转移,死亡率高。目前的观点认为,骨肉瘤的发生是一个多阶段演进和多基因参与的过程,但确切的发病机制尚未阐明。既往对骨肉瘤的研究主要集中于遗传学层面,发现TP53、RB、p16INK4、p14ARF和MDM等多个基因的扩增、重组和点突变与骨肉瘤密切相关。但随着肿瘤病因学研究的逐步深入,人们认识到肿瘤不仅仅是一种遗传性疾病,同时也是一种表遗传性疾病,几乎所有人类肿瘤中都有表观遗传的异常。其中基因印记,作为一种表遗传学机制,在肿瘤演进中发挥重要作用。基因印记是一种不遵循孟德尔定律的遗传现象,使不同亲本起源的等位基因具有不同的表达特性,呈单等位基因表达,具有这种现象的基因称为印记基因。研究发现,印记基因具有原癌基因或抑癌基因功能,其相当于功能上的单倍体,仅需一次打击就可引起以原癌基因或抑癌基因身份发挥作用的印记基因功能异常,从而增加了肿瘤发生的易感性。目前认为,DNA甲基化是基因印记形成和维持的分子基础,亲本等位基因特异性的失活就是由启动子区CpG岛（印记控制区）的甲基化作用实现的。DNA甲基化模式的异常,使印记基因功能紊乱,一方面,全基因组广泛的低甲基化引起原癌基因活化,使基因组不稳定性增加;另一方面,启动子的高甲基化可使抑癌基因失活,促进细胞的恶性转化。与基因突变不同,肿瘤发生过程中甲基化模式的异常具有可逆性,以逆转基因甲基化突变为代表的表遗传学策略,为肿瘤的治疗提供了新的思路。印记基因及甲基化修饰在肿瘤发生中的作用引起了学者们的广泛关注,研究发现父本印记的等位基因抑制生长,而母本印记的等位基因刺激生长,印记基因的表达具有时空和组织的特异性,在不同的肿瘤中具有不同的印记异常模式和甲基化表型。为了明确骨肉瘤特异性的印记基因作用模式,在前期的研究中,我们运用致癌剂MNNG和促癌剂TPA联合处理人胚永生化成骨细胞hFOB1.19,建立了成骨细胞恶性转化模型,模拟骨肉瘤的演进;通过高密度寡核苷酸芯片筛选得到骨肉瘤特异的印记基因表达谱,结果发现,10个差异表达的印记基因参与了成骨细胞的恶性转化,其中有5个位于人11p15.5染色体区,我们推测11p15.5染色体区与骨肉瘤发生密切相关。为了明确位于11p15区的这些差异表达的印记基因在骨肉瘤中的作用及调控机制,本研究选择母本印记的IGF-2基因和父本印记的TSSC3基因进一步深入研究。IGF-2基因,编码一种丝裂原蛋白肽,参与胚胎发育、细胞分化等多种生理过程。人IGF-2基因包含4个不同的启动子（P1-P4）,呈发育阶段和组织特异性的表达。在人类上皮性肿瘤和某些肉瘤中,IGF-2基因过度表达,胚胎源性的P3和P4启动子活性上调,与印记丢失、差异甲基化区域和启动子区域的低甲基化相关。在骨肉瘤中也有IGF-2基因高表达与P3和P4启动子特异转录本表达上调相关的报道,但谁是骨肉瘤发生中的优势启动子,其表达调控的机制如何,目前尚不清楚。TSSC3基因,又名IPL基因,是第一个被报道的凋亡相关印记基因,位于11p15抑癌基因区,推测其有抑制生长的效应。目前仅在Wilms’肿瘤、完全性葡萄胎和恶性胶质瘤中有表达缺失的报道,但在骨肉瘤中TSSC3基因的表达如何,参与印记形成的DNA甲基化机制是否与其表达相关,目前尚缺乏相关研究。为此,本实验分两部分进行:第一部分拟通过免疫组化、RT-PCR技术检测骨肉瘤中IGF-2基因及其相关启动子特异转录本的表达,以明确骨肉瘤中IGF-2基因的优势启动子,并采用RFLP和BSP方法检测IGF-2基因的印记状态和相关区域的甲基化表型,目的在于阐明骨肉瘤特异的IGF-2转录本相关的调控机制。第二部分拟采用RT-PCR方法检测骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞株中TSSC3基因的表达,并用DNA甲基转移酶抑制剂5-Aza-CdR处理骨肉瘤细胞,检测其对骨肉瘤细胞生物学活性的影响,分析TSSC3基因表达与启动子甲基化表型的相关性,接着对TSSC3基因的功能进行初步研究,目的在于阐明骨肉瘤中TSSC3基因的表达调控机制及可能的抑癌基因作用,为骨肉瘤的表遗传学治疗提供理论基础。主要的结果如下:1.免疫组化方法检测显示:骨肉瘤组织中IGF-2蛋白表达的阳性率为83.3% （20/24）,IGF-2蛋白的表达在骨肉瘤病理组织学分型、性别和年龄中的差异无明显统计学意义（P>0.05）。2.RT-PCR方法检测显示:20例IGF-2阳性的骨肉瘤标本中,IGF-2基因成人源性的P1启动子表达丰度为0.12±0.03,胚胎源性的P3启动子表达丰度为1.86±0.15,P4启动子的表达丰度为1.43±0.15,与胚胎肝组织中P3、P4启动子的表达一致,同时P4转录本扩增34个循环的表达丰度近似于P3转录本扩增30个循环的表达丰度,提示P3启动子的活性最高,是骨肉瘤中IGF-2基因表达的优势启动子,在非肿瘤组织中P3启动子活性亦增高,表达丰度为1.53±0.11。3.RFLP方法检测显示:20例骨肉瘤组织中有3例标本IGF-2基因印记丢失,而配对的非肿瘤组织中仅有1例印记丢失。4.BSP方法检测显示:20例骨肉瘤组织中,DMR区域CG位点的平均甲基化率在IGF-2 P3阳性标本与P3阴性标本中分别为52%±3%和43%±2%,两者之间的差异无明显统计学意义（P>0.05）;而配对的非肿瘤组织中,DMR区域CG位点的平均甲基化率在IGF-2 P3阳性标本与P3阴性标本中分别为44%±2%和51%±3%,两者之间的差异无明显统计学意义（P>0.05）;肿瘤和非肿瘤组织中DMR区CG位点的平均甲基化率与IGF-2 P3表达的相关性无明显统计学意义（P>0.05）。5.BSP方法检测显示:20例骨肉瘤组织中,IGF-2 P3启动子区域CG位点的平均甲基化率在P3阳性标本与P3阴性标本中分别为29%±2%和75%±4%,两者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）;而配对的非肿瘤组织中,IGF-2 P3启动子区域CG位点的平均甲基化率在P3阳性标本与P3阴性标本中分别为35%±3%和72%±4%,两者之间的差异具有统计学意义（P<0.05）;肿瘤和非肿瘤组织中P3启动子区CG位点的平均甲基化率与IGF-2 P3表达的相关性具有统计学意义（R=0.357, P<0.05）。6.RT-PCR方法检测显示:骨肉瘤SaOS2细胞中TSSC3表达缺失,骨肉瘤组织中TSSC3表达缺失率为54.2%（13/24）,表达丰度为0.18±0.03,较配对的非肿瘤组织低,两者之间差异具有统计学意义（P<0.05）,且TSSC3基因表达缺失与IGF-2基因过度表达的相关性具有非常显著的统计学意义（R=0.665, P=0.01）,但TSSC3基因的表达缺失在骨肉瘤病理组织学分型、性别和年龄中的差异无明显统计学意义（P>0.05）。7.BSP方法检测显示:SaOS2细胞中TSSC3基因启动子区CG位点的平均甲基化率为91%±4%,而去甲基化制剂5-Aza-CdR处理后TSSC3基因启动子区的平均甲基化率为57%±3%,较处理前明显降低,差异具有统计学意义（P<0.05）。8.MTT实验、RT-PCR、Western Blot、F-actin染色和流式细胞仪检测显示:5-Aza-CdR能抑制SaOS2细胞生长,呈明显的剂量依赖性作用,IC20浓度为7.5μM;不同浓度的5-Aza-CdR处理SaOS2细胞后TSSC3 mRNA和蛋白重新表达,其中以IC20浓度组增高最明显,表达丰度分别为0.78±0.04和0.59±0.05;处理组细胞的肌动蛋白丝较未处理组缩短并减少,伸展性差;IC20和5IC20处理组细胞的凋亡率分别为5.94%和13.97%,较未处理组细胞（0.51%）增高明显,差异具有统计学意义（P<0.05）。9.采用基因克隆技术成功构建了TSSC3表达载体pEGFP-C3-TSSC3,以脂质体方法转染SaOS2细胞后,用RT-PCR和Western Blot方法检测TSSC3基因的表达,结果显示:转染的SaOS2细胞能重组表达TSSC3基因的mRNA和蛋白。10.MTT实验、流式细胞仪和Real-time PCR方法检测显示:pEGFP-C3-TSSC3转染骨肉瘤SaOS2细胞72h后,细胞的生长抑制率为11.9%,呈明显的时间依赖性作用,细胞的凋亡率增高为9.53%,caspase-3 mRNA的表达丰度增高为1.31±0.04,与SaOS2组和pEGFP-C3-SaOS2组相比,差异具有统计学意义（P<0.05）。主要的结论如下:1.印记基因IGF-2表达上调是骨肉瘤中的高发事件。2.骨肉瘤中IGF-2 P3和P4启动子重新活化和表达,其中P3启动子转录活性最高,其高表达可能是IGF-2表达上调的主要机制之一,可能作为骨肉瘤发生中的早期事件参与骨肉瘤的演进。3. IGF-2 P3启动子低甲基化可能是上调IGF-2 P3表达的主要调控机制之一,在骨肉瘤演进中发挥促进作用,可能成为骨肉瘤早期诊断和预后评价的分子靶标。4. TSSC3基因表达缺失可能在骨肉瘤的发生和演进中起重要作用,其与IGF-2基因可能的拮抗作用共同参与骨肉瘤的演进。5. TSSC3基因启动子的高甲基化是该基因表达沉默的重要机制之一,并且TSSC3基因DNA甲基化异常是可逆的,为临床上应用去甲基化药物治疗骨肉瘤提供了理论依据。6. 5-Aza-CdR可能是通过激活TSSC3基因表达而发挥对骨肉瘤细胞的抗肿瘤作用,明确了骨肉瘤表遗传治疗的可行性,为骨肉瘤的治疗策略提供了新的思路。7. SaOS2细胞中TSSC3能发挥抑癌基因作用,其表达缺失使得细胞凋亡减少,细胞增殖紊乱,生长失控,从而促进肿瘤的发生,TSSC3有可能成为骨肉瘤治疗的新靶标。本研究从表遗传学层面探讨了骨肉瘤的发病机制,上述研究结果揭示了骨肉瘤特异的印记基因IGF-2和TSSC3的表达模式和调控机制,为骨肉瘤的早期诊断提供了新的分子靶点,为骨肉瘤的表遗传治疗提供了理论依据。

论文目录

• 英文缩写词一览表
• 英文摘要
• 中文摘要
• 论文正文 11p15.5 染色体区相关印记基因IGF-2 和TSSC3 在骨肉瘤中的表达及调控机制研究
• 前言
• 参考文献
• 第一部分 骨肉瘤中IGF-2 印记基因特异转录本表达及调控机制的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 参考文献
• 第二部分 骨肉瘤中TSSC3 印记基因表达调控机制及抑癌作用的研究
• 前言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 小结
• 附图
• 参考文献
• 全文总结
• 致谢
• 文献综述一 骨肉瘤相关抑癌基因表遗传学研究进展
• 参考文献
• 文献综述二 甲基化检测技术进展
• 参考文献
• 攻读博士学位期间发表和投稿的论文及获得的奖励
• 英文论著