siRNA对SARS冠状病毒复制的抑制作用研究

论文摘要

严重急性呼吸综合征（Severe Acute Respiratory Syndrome,SARS）是人类在21世纪初遭遇的烈性传染病之一,我国为该病的重要疫区。其病原体为SARS冠状病毒（SARS Coronavirus,SARS-CoV）。目前对其尚无特效的治疗方法,因而探索有效的抗SARS病毒新途径势在必行。 RNA干扰（RNA interference,RNAi）是基于RNA水平的抗病毒策略,凭借自身的特异、高效、快速等优势,它已成为抗病毒领域的研究热点之一。RNAi的发现和应用为治疗SARS病毒感染提供了新思路。 本研究拟开展以下两方面内容,观察siRNA对SARS病毒复制的抑制作用。探索抗SARS病毒感染的新途径。 一.siRNA的设计合成及其对SARS病毒部分复制酶基因的抑制作用 由于复制酶基因的表达是SARS病毒启动转录的前提,而刺突蛋白在病毒入侵宿主细胞的过程中发挥着重要作用,因此选择SARS病毒复制酶基因（rep）和刺突蛋白基因（s）的保守序列作为靶基因,设计并合成9种siRNA（pS01～09）,其中pS01～07针对rep基因,pS08～09针对s基因。由于体外合成的siRNA不易操作且基因干涉作用持续时间短,故采用构建siRNA表达载体的方法在体内合成siRNA。 同时,构建融合表达绿色荧光蛋白（GFP）基因和部分rep基因的重组载体,将已构建好的识别rep基因的siRNA表达载体与重组载体共转染293T细胞,通过荧光显微镜观察和流式细胞仪分析融合基因的表达情况。结果表明,针对SARS病毒rep基因第3504nt-3522nt的siRNA可使rep基因的表达量下降33%,说明siRNA可特异而有效地抑制基因的表达。 二.siRNA在Vero细胞中的抗SARS病毒作用 为进一步研究siRNA对SARS病毒复制的抑制作用,将构建的siRNA表达载体分别转染Vero细胞,获得稳定转录siRNA的克隆细胞株V/pS01、03、05～09及对照细胞株V/pSN,然后以BJ01株病毒悬液感染克隆细胞,通过病毒滴度测定和间接免疫荧光实验观察siRNA对SARS病毒复制的抑制作用。结果表明,针对rep基因和s基因的siRNA（pS05和pS08）呈现出了良好的抗病毒效果,在接种SARS病毒后均未检测到病毒的特异性抗原,且病毒滴度下降103～104倍。另外,通过实时定量RT-PCR检测病毒感染的细胞上清中rep基因的含量,结果显示,细胞株V/pS05中rep

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 前言
• 第一部分 siRNA的设计合成及其对SARS-CoV复制酶基因表达的抑制作用
• 第二部分 siRNA对SARS-CoV复制的抑制作用研究
• 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 硕士期间发表的论文
• 致谢
• 英文缩略词表