论文摘要
可变剪接是指从一个mRNA前体中由剪接体参与产生不同的mRNA剪接变异体的过程,它是一种广泛的RNA加工机制,是调节基因表达和产生蛋白质组多样性的重要方式。SR蛋白（serine/arginine-rich proteins, SR proteins）是一类重要的参与剪接调控的剪接因子。其成员多带有1个或2个拷贝的RNA识别基序（RNA-recognition motif,RRM）,后面接有富含精氨酸/丝氨酸（Arg/Ser-rich,RS）重复序列的结构域。RRM介导SR蛋白与RNA结合,并决定各SR蛋白的底物特异性;RS结构域参与蛋白-蛋白间相互作用。到目前为止,人类已发现10种SR蛋白,而且它们均是磷蛋白,其功能和定位受磷酸化严格调节。SRp55是SR蛋白家族中的一员,它在果蝇神经系统发育过程中起到了非常重要的作用,但在其他哺乳动物内的相关研究还比较少。SRp55的氨基端（N-端）有2个RRM亚结构域,羧基端（C-端）有2个不连续的RS亚结构域。经分析SRp55蛋白序列上含有多个潜在的可被磷酸化的位点,因此发现和探讨哪些蛋白激酶及磷酸酶参与对SRp55磷酸化调控显得十分重要。Dyrk1A（dual-specificity tyrosine- phosphorylated and regulated kinase 1A）是一种脯氨酸/精氨酸指导的丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶。Dyrk1A主要表达在细胞核中,并发现其可磷酸化多种转录因子和剪接因子。它位于21号染色体上与唐氏综合征（Down syndrome,DS）有关的关键区域。唐氏综合征患者的Dyrk1A由于多一个拷贝,其表达量和活性均增加～50%。陆续的报道显示DS可能存在某些mRNA可变剪接的异常。因此本实验研究Dyrk1A是否可以磷酸化SRp55,两者是否存在生理上的相互作用,以及Dyrk1A能否影响SRp55对tau外显子10可变剪接的调控。我们首先表达并纯化了GST-SRp55融合蛋白,在体外用Dyrk1A对其磷酸化,我们发现Dyrk1A能有效地磷酸化SRp55,并且其磷酸化位点主要位于SRp55的Pro-rich和RS1亚结构域。GST-pull down、免疫共沉淀及细胞内共定位这三种经典的研究蛋白质相互作用的方法,证实了Dyrk1A和SRp55之间存在生理上的相互作用,并由其RS2亚结构域介导。Dyrk1A和SRp55主要定位在细胞核内,Dyrk1A对SRp55的磷酸化作用可以影响SRp55在细胞核内的定位。过表达Dyrk1A促进SRp55转位到核斑中。RS2的缺失使得SRp55在核斑内的富集能力减弱,而进一步缺失整个RS结构域改变了SRp55在细胞内的分布,并部分定位在细胞质中。利用RT-PCR技术,我们发现SRp55在不同的细胞系均不同程度的促进tau外显子10的表达,有利于4R-tau（four microtubule-binding repeats,exon 10+）的产生。过表达Dyrk1则影响SRp55对tau外显子10表达的促进作用。结论:1. Dyrk1A在体外有效的磷酸化SRp55,磷酸化位点主要集中在SRp55的Pro-rich和RS1亚结构域。2. Dyrk1A和SRp55存在生理上的相互作用,其相互作用依赖于SRp55的RS2区的存在。3. Dyrk1A过表达促进SRp55转位至核斑中。4. Dyrk1A影响SRp55介导的可变剪接,在tau外显子10的可变剪接中促进其表达。