葡萄糖氧化酶（GO）基因在番茄中的遗传转化及其抗病机理研究

论文题目: 葡萄糖氧化酶（GO）基因在番茄中的遗传转化及其抗病机理研究

论文类型: 博士论文

论文专业: 蔬菜学

作者: 王全华

导师: 王秀峰

关键词: 番茄,葡萄糖氧化酶基因,遗传转化,抗病机理,后代遗传

文献来源: 山东农业大学

发表年度: 2005

论文摘要: 植物在抵御病原侵染时产生一系列的防御机制。在病原侵染的位点上坏死斑的形成与诸如细胞壁的加强、植保素合成及病程相关蛋白的积累等的防御反应相关联。在植物和病原菌的相互作用中,最早响应之一是O2-（Superoxide）,OH-（Hydroxy radical）和H2O2等活性氧的大量急剧产生,而且这种活性氧的迸发被假设是由超敏反应（HR）介导的。活性氧不仅具有直接杀死病原菌的作用,而且作为信号分子诱导防御系统基因的表达,并最终诱导系统产生获得性抗性。葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase,GO）可以催化β-D-葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和H2O2。很多真菌产生GO 作为一种抗微生物的代谢物拮抗微生物用以生防控制。因为H2O2能有效地抑制细菌和真菌的生长,参与膜脂过氧化,而且H2O2 促进细胞壁木质化和HR 细胞的死亡。此外, H2O2 是一种扩散的小分子,跨过细胞膜进入病原菌侵染点以外的组织中,作为第二信使激活防卫基因的表达,最终导致对病原菌产生抗性。由于GO 的这种特性为抗病植物的选育提供了一条新的途径。很多试验证实转GO 基因植物显示出对病原菌的广谱抗病性。1 番茄组织再生及其遗传转化体系的优化本研究首先以番茄10 个自交系为试验材料,分别研究其不同激素组合对出愈和诱芽的影响,筛选出番茄自交系外植体再生的最佳激素组合为MS+ZT 2.0mg/L+IAA 0.5mg/L。试验结果表明,10 个番茄自交系间外植体出愈率和诱芽率均存在较大的差异说明基因型不同的自交系材料,其内源激素水平有所差异。同时研究出再生植株生根的最适宜培养基为MS 培养基中添加0.5mg/L IAA。采用正交试验设计,利用上述筛选出的再生体系对农杆菌侵染条件进行优化。结果表明,预培养2-3 天、农杆菌的稀释30 倍、侵染时间20min,共培养2 天,即可达到最佳的遗传转化效果,使番茄植株遗传转化效率达到最大化。2 植物表达载体的构建及在番茄中的遗传表达本研究构建了由病原诱导启动子驱动的来自于黑曲霉的GO 基因植物表达载体pCPGO,通过农杆菌介导,采用叶盘法进行番茄5 个自交系的遗传转化,获得了58 株转基因植株。经PCR 检测和Southern 杂交分析证明GO 基因已整合到番茄基因组中。Northern 杂交结果表明GO 基因在转录水平上已经表达。而且通过H2O2 定性和定量检测证明了GO 基因的表达。所有转基因植株的结实率都有不同程度的减少,转基因番茄

论文目录:

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英文摘要

第一章 引言

1 植物抗病的物质基础及抗病机理研究进展

1.1 病原致病作用

1.2 植物的抗病机制

1.3 抗病反应的物质基础

1.4 活性氧的种类及其作用

1.5 植物-病原互作中 AOS 的产生

1.6 活性氧的清除系统

1.7 H_2O_2 与植物抗病反应及抗病信号转导

1.8 提高植物抗氧化能力的基因工程

2 番茄基因工程研究进展

2.1 番茄抗虫基因工程研究进展

2.2 番茄抗病害基因工程研究进展

2.2.1 番茄抗真菌病害的研究

2.2.2 番茄抗细菌病害的研究

2.2.3 转抗线虫病基因育种

2.2.4 转抗病毒病基因育种

2.3 番茄基因工程育种前景与展望

3 葡萄糖氧化酶基因在植物育种中的应用

3.1 葡萄糖氧化酶基因的来源

3.2 H_2O_2 在植物抗病中的作用

3.3 GO 基因在植物抗病育种中的应用

4 本研究的目的和意义

第二章 番茄组织再生及其遗传转化体系的优化

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 番茄材料

1.1.2 菌种

1.1.3 培养基

1.1.4 植物激素

1.1.5 抗生素

1.2 试验方法

1.2.1 无菌苗的准备

1.2.2 培养基

1.2.3 外植体接种培养方法

1.2.4 诱导生根

1.2.5 试管苗的移栽

1.2.6 番茄的植物转化

1.2.7 子叶转化的因素及其水平设计

2 结果与分析

2.1 外植体接种后形态变化

2.2 不同激素组合对愈伤组织及芽形成的影响

2.3 ZT+IAA 不同浓度组合对不定芽分化数目和生长的影响

2.4 A 组合对不同番茄自交系愈伤组织和不定芽形成的影响

2.5 不同激素配比对番茄再生植株生根的影响

2.6 农杆菌侵染条件的优化

2.7 PPT 和 Cb 对番茄子叶外植体再生能力的影响

2.8 试管苗的移栽结果

3 讨论

3.1 外源激素对番茄组织培养体系建立的影响

3.2 基因型对番茄组织培养体系建立的影响

3.3 关于番茄遗传转化体系的优化

3.4 关于再生芽的生根问题

3.5 番茄外植体再生途径实现的探讨

第三章 植物表达载体的构建及在番茄中的遗传表达

1 试验材料

1.1 植物材料

1.2 菌株和质粒

1.3 分子生物学及生化试剂

1.4 PCR 引物

1.5 培养基

1.6 植物表达载体的构建

1.6.1 目的基因 DNA 的获得

1.6.2 凝胶中回收 DNA 片段

1.6.3 植物表达载体pCPGO 的构建

1.6.4 感受态细胞的制备

1.6.5 质粒向大肠杆菌中转化

1.6.6 重组质粒的筛选

1.7 植物表达载体pCPGO 导入土壤农杆菌

1.7.1 根癌农杆菌 LBA4404 感受态细胞的制备

1.7.2 冻融转化法将目的基因导入根癌农杆菌 LBA4404

1.7.3 根癌农杆菌菌落的 PCR 检测

1.8 外植体的准备

1.9 侵染农杆菌的制备

1.10 不同品系番茄转化及植株再生

1.11 再生植株的 PCR 检测

1.12 转基因番茄的 Southern 杂交

1.13 转基因番茄的 Northern 杂交

1.14 转基因番茄植株中 H_2O_2 的定性及定量检测

1.15 转基因番茄的抗病性鉴定

2 结果与讨论

2.1 植物表达载体的构建

2.2 植物表达载体pCPGO 的鉴定

2.2.1 PCR 鉴定

2.2.2 酶切鉴定

2.3 番茄的遗传转化

2.4 转基因植株总 DNA 的 PCR 检测

2.5 转基因番茄的 Southern 杂交分析

2.5.1 Southern blotting 探针制备

2.5.2 基因组的酶切

2.5.3 Southern 杂交

2.6 转基因番茄的 Northern 杂交分析

2.7 转基因番茄 GO 基因表达的定性和定量检测

2.8 种子结实率和萌发率的测定

2.9 转基因植株的抗病性鉴定

2.9.1 叶霉病抗性鉴定

2.9.2 晚疫病抗病性鉴定

3 讨论

第四章 葡萄糖氧化酶(GO)基因的抗病生理生化变化

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 接种方法

1.2.2 酶液的提取

1.2.3 酶活性测定

1.2.3.1 SOD 活性测定

1.2.3.2 POD 活性测定

1.2.3.3 CAT 活性测定

1.2.3.4 APX 活性测定

1.2.3.5 PPO 活性测定

1.2.3.6 PAL 活性测定

1.2.4 同工酶电泳分析

1.2.4.1 试验装置

1.2.4.2 凝胶储备液的制备

1.2.4.3 凝胶配方

1.2.4.4 缓冲液的配制

1.2.4.5 电泳条件

1.2.4.6 染色配方及染色步骤

2 结果与分析

2.1 SOD 和 POD 酶活性的变化

2.2 CAT 酶活性的变化

2.3 PAL 酶活性变化

2.4 PPO 活性变化

2.5 APX 活性变化

2.6 同工酶酶谱分析

2.6.1 SOD 酶谱分析

2.6.2 POD 酶谱分析

2.6.3 PPO 酶谱分析

2.7 抗病性鉴定结果分析

3 讨论

第五章 转 GO 基因番茄后代遗传研究

1 材料与方法

1.1 材料

1.2 方法

2 结果与分析

2.1 转基因番茄自交后代遗传分离

2.1.1 转基因自交后代主要农艺性状的表现

2.1.2 转基因株系主要农艺性状与对照的差异

2.1.3 GO 基因在番茄 T1 代植株中的分离

2.1.4 GO 基因在转基因番茄后代的遗传分离

2.2 GO 基因在杂交后代遗传分离

2.2.1 GO 基因在杂交分离世代的遗传表现

2.2.2 GO 基因在回交世代的遗传表现

2.3 分子检测

2.3.1 PCR 扩增结果

2.3.2 Southern 杂交分析

2.3.3 转基因番茄后代抗病性鉴定

3 讨论

第六章 结论

参考文献

致谢

攻读博士学位期间发表的论文

发布时间: 2005-10-11

参考文献

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