论文摘要
前言原发性肝胆管色素结石引起的胆道感染在我国是常见病和多发病。在胆管色素结石存在的情况下,病人通常呈无症状胆汁带菌状态;当发生急性胆道梗阻、胆道高压时则出现急性胆管炎的表现。研究表明,胆管色素结石引起的胆道感染通常为G-杆菌、G+球菌和厌氧菌引起的混合感染,其中大肠杆菌是引起胆道感染的代表菌株。目前对于胆道感染的细菌学方面研究仅限于对胆汁、胆石的细菌培养及细菌的药物敏感性及某些酶学方面的研究。对于能够引起胆道感染的细菌的全部特点及细菌与宿主之间相互作用机制方面的研究很少。这两个方面的研究对于理解细菌的来源、细菌的侵入途径、细菌的作用位点以及机体对细菌的先天和后天免疫防御反应等方面具有重要意义,对于理解肝胆管色素结石的成因具有重要意义,对于寻找预防和治疗胆道感染及肝胆管色素结石的新方法和新途径具有重要意义。本文通过对引起胆道感染的大肠杆菌P菌毛的表达及papG粘附素基因的检测,来明确胆道感染大肠杆菌的另一个特点—粘附特性;通过对急性重症胆管炎大鼠模型多器官NF-kB、TLR-4、TLR-2的表达,来明确机体对病原微生物的先天和后天免疫防御反应,探讨急性重症胆管炎时多器官功能不全的机理,并对从感染的始动环节进行干预,减轻全身炎症反应综合症和多器官功能不全提供理论依据。实验方法一、实验对象1.收集中国医科大学附属盛京医院临床微生物室保留的从胆道感染病人胆汁内培养出的大肠杆菌菌株34例及从健康志愿者粪便中分离出的大肠杆菌菌株8例,分别进行甘露醇抗性血凝试验（MRHA）,并应用PCR法扩增所有菌株3型papG粘附素基因并进行分析比较。2.Wistar大鼠,160-220g,雌雄不限。制成急性重症胆管炎大鼠模型（胆道梗阻+E.coli）作为实验组（36例）,单纯胆道梗阻模型（胆道梗阻+Saline）作为对照组（18例）。二、标本采集1.采集实验组和对照组不同时点（1h、6h和24h）大鼠血标本、肝脏组织标本、肺脏组织标本和小肠组织标本。2.一部分组织标本立即置入-80℃保存,待行RT-PCR和Western-Blot检测;另一部分立即置入5%多聚甲醛溶液中固定,待行组织病理和免疫组织化学检测。三、检测指标1.P菌毛表达检测:应用甘露糖抗性血凝试验（MRHA）对42株大肠杆菌进行检测,凡凝集当时或4℃过夜,观察凝集反应呈≥“++”者,判定为阳性。2.papG粘附素基因检测:应用PCR扩增,检测42株大肠杆菌粘附素等位基因papGⅠ、papGⅡ、papGⅢ的表达情况。3.血清炎症介质和细胞因子检测:应用ELISA方法检测实验组和对照组不同时点血中TNF-α、IL-10、IL-4浓度,表明全身炎症反应强度。4.肝脏、肺脏、回肠组织病理学检测:检测实验组和对照组不同时点肝脏、肺脏、回肠组织病理学改变,表明组织病理学改变程度。5.NF-kB蛋白表达检测:应用免疫组织化学方法检测在肝脏、肺脏及小肠组织中的定位表达情况,应用Western-Blot方法检测NF-kB在肝脏组织中的定量表达情况。6.NF-kB mRNA表达检测:应用RT-PCR方法检测NF-kB mRNA在肝脏、肺脏及小肠组织中的定量表达情况。7.TLR-4、TLR-2蛋白表达检测:应用免疫组织化学方法检测在肝脏、肺脏及小肠组织中的定位表达情况,应用Western-Blot方法检测TLR-4、TLR-2在肝脏组织中的定量表达情况。8.TLR-4、TLR-2 mRNA表达检测:应用RT-PCR方法检测TLR-4、TLR-2mRNA在肝脏、肺脏及小肠组织中的定量表达情况。实验结果1.P菌毛表达检测:胆道内大肠杆菌P菌毛表达阳性率为47.06%（16/34）,显著高于肠道内大肠杆菌P菌毛表达阳性率0%（0/8）（p＜0.05）。2.papG粘附素基因检测:胆道内大肠杆菌粘附素等位基因papGⅠ、papGⅡ、papGⅢ的表达阳性率分别为67.65%,44.12%,82.35%,其中papGⅢ显著高于肠道内大肠杆菌的表达阳性率37.5%（p＜0.05）。3.血清炎症介质和细胞因子检测:实验组外周血中TNF-α、IL-4水平术后1h即显著升高,6h达到峰值,均显著高于对照组,24h有所下降。IL-10浓度在术后1h即达到峰值,并显著高于对照组,此后随时间变化逐渐下降。4.肝脏、肺脏、回肠组织病理学检测:肝脏实验组1h组可见肝细胞浊肿,肝窦、肝细胞周围及汇管区有少量炎细胞浸润。6h组可见肝细胞浊肿明显,排列疏松紊乱,明显脂肪变性,有散在的点状坏死灶,坏死灶内较大量炎细胞浸润;12h组病理改变同6h组,程度更严重,坏死灶较多,呈大片状,脓肿形成,内有大量炎细胞浸润。肺脏实验组1h组肺泡壁增厚,间质渗出,少量炎细胞浸润。6h组可见肺内出血,肺间质渗出增多,肺实变加重,较大量炎细胞浸润;12h组病理改变同6h组,程度更严重,可见有肺出血及脓肿、坏死灶形成。回肠病理形态学改变不大,实验组24h组可见小肠粘膜少量炎细胞浸润。5.NF-kB蛋白表达检测:免疫组化发现重症胆管炎大鼠术后1h、6h、24h可见肝细胞、肺上皮细胞、肠粘膜上皮细胞内有棕色颗粒均匀分布于细胞浆,部分位于细胞核内,其中以肝细胞6h组最为明显。对照组大鼠相应组织则为阴性或仅有少量阳性染色细胞。Western-Blot方法检测到重症胆管炎和对照组大鼠术后肝组织NF-kB蛋白的表达,与相应mRNA表达规律一致;重症胆管炎大鼠NF-kB在术后6h显著高于对照组（11805.67±2410.69 vs9888.67±244.85.p=0.026）。6.NF-kB mRNA表达检测:重症胆管炎大鼠术后1h肝组织NF-kB mRNA即升高,6h达到高峰并显著高于对照组（1.95±1.67 vs 0.75±0.22,p=0.001）,24h下降。肺组织NF-kB mRNA表达与肝一致。术后1h NF-kB mRNA即升高,6h达到高峰并显著高于对照组（1.69±0.36 vs 0.58±0.19,p=0.033）,24h下降。重症胆管炎大鼠术后1h肠组织NF-kB mRNA即升高（0.38±0.16 vs 0.25±0.04,p=0.001）,6h达到高峰（0.86±0.34 vs 0.57±0.05,p=0.003）,24h下降（0.63±0.24 vs 0.25±0.05,p=0.011）,均显著高于对照组。7.TLR-4、TLR-2蛋白表达检测:应用免疫组织化学方法发现对照组1h、6h、24h组肝脏、肺脏及小肠未见或仅有少量TLR-4和TLR-2表达。急性重症胆管炎大鼠1h即可在肝脏、肺脏中表达,6h组表达最强,24h表达减弱。TLR-4和TLR-2表达均位于胞浆内。Western-Blot方法检测到重症胆管炎和对照组大鼠术后肝组织TLR-2的表达随时间的延长,表达逐渐增强,6h达到高峰（11278.50±1066.73 vs 8434±470.57,p=0.03）,24h略有下降但显著高于对照组（10964.67±883.33 vs 8288.83±212.53,p=0.008）。重症胆管炎和对照组大鼠术后肝组织TLR-4的表达与TLR-2一致,1h增高（8613.33±1999.22vs 6406.50±224.98,p=0.05）,6h达到峰值（11209.33±1271.09 vs 7287.33±240.78 p=0.12）,24h略有下降。8.TLR-4、TLR-2 mRNA表达检测:应用RT-PCR方法检测到重症胆管炎大鼠术后肝组织TLR-4mRNA术后1h即开始升高,6h达峰并显著高于对照组（14.80±2.58 vs 9.30±1.08 p=0.002）,24h开始下降。肺组织TLR-4mRNA术后1h即开始升高,6h达峰,24h后轻度下降（8.02±1.32 vs 4.67±0.53p=0.037）。肠组织TLR-4mRNA表达与肝、肺组织相似,即术后11h即开始升高（8.25±2.14vs5.01±0.68 p=0.05）,6h达峰,24h开始下降,但显著高于对照组（7.89±3.14 vs 6.96±1.07 p=0.001）。重症胆管炎大鼠术后肝组织TLR-2mRNA术后1h即开始升高（1.51±0.83 vs 1.18±0.25 p=0.002）,6h达峰,24h下降。肺组织TLR-2mRNA术后1h即开始升高,（10.13±5.20 vs5.54±1.12 p=0.001）,6h达峰（11.59±5.11 vs6.89±1.07 p=0.001）,24h后下降。肠组织TLR-2mRNA表达术后1h小时即开始升高,6h达峰（4.78±1.83vs2.05±1.40 p=0.002）,24h开始下降,但仍显著高于对照组（4.52±1.30 vs 2.59±1.36 p=0.004）。结论1.致胆道感染大肠杆菌P菌毛表达阳性率显著高于正常肠道内大肠杆菌;2.致胆道感染大肠杆菌papG粘附素基因表达阳性率显著高于正常肠道内大肠杆菌,且以papGⅢ为主;3.重症胆管炎大鼠肝脏、肺脏及小肠组织NF-kB活化,与血中促炎介质和细胞因子呈正相关;随时间变化,促炎及抗炎介质出现失衡;4.重症胆管炎大鼠肝脏、肺脏及小肠组织TLR-4、TLR-2表达明显增强,并与相应组织中NF-kB及血中促炎介质和细胞因子呈正相关。
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