论文摘要
研究背景目前研究表明恶性肿瘤的发生与细胞分化紊乱或分化阻滞密切相关,而肿瘤治疗不管是放疗、化疗,还是分子靶向治疗以及生物治疗,都是采取杀灭肿瘤细胞的治疗理念,这些治疗方法在杀灭肿瘤细胞的同时对正常细胞也有一定的杀伤作用。越来越多的研究表明,在体内外诱导分化剂的作用下,恶性肿瘤细胞的形态、生物学或生物化学方面的诸多标志均向正常细胞的方向演化分化,甚至完全转变成正常细胞或接近正常细胞,这种现象称肿瘤细胞的再分化（redifferentiation）,因此诱导分化治疗将成为未来肿瘤治疗的一个新的发展方向。霍奇金淋巴瘤（Hodgkin lymphoma, HL）是一种淋巴造血系统的恶性肿瘤,1832年由英国的Thomas Hodgkin最早描述,其中经典型霍奇金淋巴瘤（classic Hodgkin lymphoma, cHL）约占霍奇金淋巴瘤病例的95%。该疾病的典型形态特点是少数的肿瘤性H/RS （Hodgkin/Reed-sternberg）细胞（<1%）浸润在大量的炎性反应背景细胞中。170多年来,H/RS细胞的本质以及发生发展机制等问题一直困扰着医学界。Kuppers等采用显微切割技术从组织切片上挑取单个H/RS细胞,通过单细胞PCR技术分析Ig基因重排证实绝大部分的H/RS细胞来自淋巴器官生发中心（germinal center, GC）的前凋亡B细胞,也称为“残疾的B淋巴细胞”,该细胞具有B细胞表型丢失和发育不全的早期浆细胞分化潜能等B细胞分化紊乱的特点。寻找H/RS细胞发生过程中导致分化阻滞的关键靶点,调节其“开关”,使H/RS细胞复现B细胞的特征,回到B细胞分化的正常方向,是本研究的关键。有报道反义CD99表达质粒转染人B淋巴瘤细胞株BJAB和IM9后,形态和免疫表型与H/RS细胞极为相似,提示CD99表达下调是H/RS细胞形成关键分子事件。转录因子PRDM1,诱导B细胞向浆细胞分化的一个开关,是浆细胞分化所必需的至关重要的调控因子。目前研究认为在cHL中PRDM1是一个重要的抑癌基因,其功能性失活阻断了B细胞向成熟浆细胞的分化,可能是cHL致病重要原因。H/RS细胞具有早期浆细胞分化潜能,诱导H/RS细胞向末端B细胞方向再分化必须打开PRDM1这一浆细胞调节关卡。最近研究发现miRNA在B细胞分化和B细胞恶性肿瘤中发挥重要作用。Nie等通过荧光素酶报告实验证实在cHL细胞株L428中PRDM1是miR-9调控的直接靶标,miR-9可以负性调控PRDM1的表达。因此,miR-9可能是导致H/RS细胞分化阻滞的又一重要靶标。本课题组前期构建了CD99基因稳定过表达的cHL细胞株L428细胞亚系,命名为“L428-CD99”,在此基础上本研究采用免疫细胞化学、实时荧光定量RT-PCR、Western blot、免疫荧光共聚焦、原位杂交、miRNA反义寡核苷酸瞬时转染、生物信息学分析等方法,在对L428-CD99细胞亚系进行系列鉴定后,观测上调CD99后L428细胞B细胞分化相关表型、细胞形态学和细胞生物学行为等改变,明确上调CD99的H/RS细胞能否复现B细胞表型、打开向浆细胞分化的开关基因PRDM1并诱导向末端B细胞方向再分化可能性及调控机制,验证miR-9在I-H/RS细胞的表达、对靶点PRDM1的调控关系及探讨诱导再分化可能性,为进一步阐述H/RS细胞的发生发展机制提供参考依据。研究目的本研究拟通过四部分进行：一、CD99和PRDM1在cHL组织和细胞水平的表达观测CD99和PRDM1在淋巴结反应性增生（reactive lymphoid hyperplasia,RH）、cHL组织及其细胞株、B及T细胞淋巴造血系统肿瘤细胞株中的表达差异。二、CD99调控PRDM1的表达诱导H/RS细胞再分化探究CD99和PRDM1的调控关系,明确上调CD99基因对cHL细胞株L428细胞诊断标记、B细胞免疫表型以及浆细胞表型的影响,揭示CD99基因在cHL发生及分化所扮演的角色。三、miR-9在H/RS细胞中的表达及对靶点PRDM1的调控定量和定位、转染沉默验证miR-9在L428细胞的表达及对靶点PRDM1的调控。四、CD99和miR-9相互调控关系的初步研究初步实验并借助生物信息学分析CD99和miR-9的相互调控网络,探究CD99、miR-9和PRDM1的调控关系。研究内容与方法一、CD99和PRDM1在cHL组织和细胞水平的表达收集cHL和RH组织标本,通过CD99和PRDM1的免疫组化比较其在组织上的表达差异,并进一步通过Western blot和免疫细胞化学方法检测CD99和PRDM1在六株B细胞来源和三株T细胞来源淋巴瘤细胞株的表达。二、CD99调控PRDMl的表达诱导H/RS细胞再分化1.L428-CD99细胞亚系的鉴定对前期构建的慢病毒质粒稳定过表达CD99基因的L428-CD99克隆株,经荧光显微镜观察载体绿色荧光蛋白表达,利用实时荧光定量RT-PCR、Western blot和免疫荧光共聚焦检测CD99 mRNA和蛋白表达。2.CD99基因过表达对cHL细胞株L428形态特征和生物学特性的影响利用MTT实验、HE染色和鬼笔环肽染色检测CD99基因过表达对L428细胞增殖能力、形态大小以及细胞骨架蛋白的影响。3.CD99基因上调对L428细胞分化相关蛋白的影响经Western blot和免疫荧光共聚焦检测CD99基因过表达前后PRDM1蛋白的表达；利用免疫细胞化学和流式细胞检测cHL诊断标记（CD30和CD15）、B细胞分化相关抗原（CD10、CD19、CD20、CD45、CD79α、BCL6、PAX5和MUM1）以及浆细胞标记（CD38和CD138）。三、miR-9在H/RS细胞中的表达及对靶点PRDM1的调控1.检测miR-9在L428细胞的表达利用免疫磁珠分选人正常淋巴结CD19+B淋巴细胞作对照；实时荧光定量RT-PCR和原位杂交检测CD19+B淋巴细胞和包括L428细胞株在内的8株淋巴瘤细胞株miR-9的表达。2.瞬时干扰miR-9对L428细胞PRDM1蛋白表达和增殖能力的影响miR-9反义寡核苷酸瞬时转染L428细胞,荧光显微镜观察分析转染效率,实时荧光定量RT-PCR检测干扰效率；Western blot和免疫荧光共聚焦检测敲低miR-9后PRDM1蛋白的表达；MTT实验分析miR-9反义寡核苷酸对L428细胞增殖能力的影响。四、CD99和miR-9相互调控关系的初步研究采用实时荧光定量RT-PCR检测CD99基因过表达前后miR-9的表达；利用实时荧光定量RT-PCR和Western blot检测miR-9干扰前后CD99的表达；通过生物信息学分析CD99和miR-9之间的信号调控通路。结果一、CD99和PRDM1在cHL组织和细胞水平的表达1.在RH组织,CD99主要表达于淋巴滤泡外套区和滤泡间区,PRDM1在生发中心的明带呈散在弱阳性表达；62例cHL组织中,只有1例CD99在H/RS细胞表达阳性,所有病例PRDM1均呈阴性表达。2.CD99和PRDM1蛋白在多发性浆细胞性骨髓瘤细胞株RPMI-8226中表达较高,在L428细胞和其他B细胞起源的淋巴瘤细胞株中表达较低甚至缺失。二、CD99调控PRDM1的表达诱导H/RS细胞再分化1.L428-CD99细胞亚系在荧光显微镜下均可见较强的绿色荧光,实时荧光定量RT-PCR、Western blot和共聚焦显微镜检测显示,与裸细胞组和空载体组比较,L428-CD99细胞亚系CD99基因和蛋白表达均增高。2.MTT检测发现,CD99基因过表达组较空载体组增殖减慢,差异具有显著性（F=305.917,P=0.000）；HE染色后计数,L428-CD99细胞亚系20+uM细胞数占总细胞数比例为（50.187±2.518）%,较对照组细胞（77.588±5.580）%比例低,差异具有显著性（Z=-2.611,P=0.008）；鬼比环肽染色发现,与对照组相比,L428-CD99细胞丝足消失,皮层丝状肌动蛋白变薄。3. Western blot和共聚焦检测结果显示,相对于裸细胞组和空载体组,CD99基因过表达组PRDMl蛋白表达明显增加；免疫细胞化学和流式细胞检测发现,CD99基因过表达后,与对照组相比,CD30、CD15和MUM1表达降低,CD10、CD19、CD79αBCL-6、PAX5和CD38表达增高,而CD20和CD138的表达没有明显改变。三、miR-9在H/RS细胞的表达及对靶点PRDM1的调控1.实时荧光定量RT-PCR检测发现,与分选CD19+B细胞和其他细胞株相比,miR-9在L428细胞的表达较高,差异均具有显著性（P<0.05）；原位杂交结果显示,miR-9的表达定位于胞浆,其在L428细胞呈弥漫强阳性表达,在DLBCL和Burkitt’s淋巴瘤细胞株呈散在弱阳性表达,在T细胞来源的]KARPAS-299和Jurkat细胞表达阴性。2.实时荧光定量RT-PCR检测发现,与对照组相比,miR-9反义寡核苷酸组miR-9的表达水平下降了50%左右,差异具有显著性（t=-5.208,P=0.035）。3. Western blot和免疫荧光共聚焦结果显示,miR-9反义寡核苷酸组PRDM1蛋白表达相对裸细胞组和对照组显著升高。4.MTT检测发现,裸细胞组、对照组（NCi）和miR-9反义寡核苷酸转染组（miR-9i）不同组别间细胞增殖活性差异不具有统计学意义（F=1.069,P=0.350）。四、CD99和miR-9相互调控关系的初步研究1.实时荧光定量RT-PCR结果显示,CD99转染L428细胞组相对于空载体组miR-9的表达水平显著降低,差异具有统计学意义（t=282.071,P=0.000）。2.实时荧光定量RT-PCR检测发现,miR-9i组CD99的表达水平与对照组（NCi）和裸细胞组相当,差异不具有显著性（P=0.719和P=1.000）；Western blot结果显示,与对照组（NCi）和裸细胞组相比,miR-9反义寡核苷酸转染组CD99蛋白水平未发生明显改变。3.生物信息学分析结果表明,CD99可能通过KPNB1的中间连接与SMAD3和SMAD4联系,进一步和MYC作用,调控miR-9的表达。结论1.CD99和PRDM1在cHL组织和细胞株呈较低或缺失表达。2.L428-CD99细胞亚系过表达载体稳定、CD99基因和蛋白表达水平较高,细胞增殖减慢、体积变小、细胞骨架重构；CD99基因的过表达导致H/RS细胞丢失cHL诊断标记,重现B细胞表型,上调浆细胞分化关键因子PRDM1蛋白表达,出现浆细胞标记,具有前浆母细胞分化特征。3.miR-9在L428细胞特异性高表达；miR-9可以负性调控PRDM1的表达。4.CD99可以负向调控miR-9表达,但miR-9不能反作用于CD99; CD99很可能通过调控miR-9进而调节PRDM1的表达。创新之处1.提出H/RS细胞的产生和B细胞分化阻滞和分化紊乱密切相关,揭示了CD99、rniR-9和PRDM1与cHL的发生发展紧密关联；2.初步揭示CD99基因可能通过调节miR-9介导的PRDM1表达,从而诱导H/RS细胞复现B细胞表型,并向末端B细胞方向再分化,为阐明cHL的发生机制提供帮助,为诱导分化治疗提供理论依据和精确靶标,具有原始创新性。
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