棉花单染色体分离和DNA纤维FISH及其应用研究

论文摘要

棉花是世界上最主要的天然纤维作物,棉花基因组测序已进入实质性阶段,因此积累棉花基因组测序的基础性资料和解决关键依赖技术已经迫在眉睫。本研究根据棉花细胞富含棉酚和丹宁等次生代谢物质,棉花染色体小、形态相似、制片困难的特点,探索建立完整的棉花FISH技术体系,同时针对棉花多倍体的特征,探索棉花单染色体分离技术,建立单染色体文库,为棉花基因组测序、基因克隆、染色体涂色乃至进化研究积累基础性资料。主要研究结果如下:1.棉花染色体微分离、微克隆技术体系的建立。采用前低渗、酶解、后低渗和压片相结合的方法获得适于切割的中期染色体膜制片,进而形成一套行之有效的单染色体切割流程。棉花单染色体扩增后,通过Southern杂交、SSR引物扩增和荧光原位杂交验证,形成了完整的分析验证体系。首次建立了一套高效、快捷、易于操作的棉花染色体微分离、微克隆技术体系。2.棉花染色体涂色研究。根据棉种间染色体涂色研究,发现两个二倍体棉种亚洲棉和草棉之间的同源性很高;在五个四倍体棉种中,亚洲棉与陆地棉、海岛棉的同源性较高,而与黄褐棉、达尔文棉的同源性较低,与毛棉的同源性最差,说明棉花四倍体属多系起源可能更可信。3.棉花单染色体文库的构建。建立了亚洲棉石系亚1号的第5号染色体文库,含有37000个克隆重组子,插入片段大小为500～1800bp,平均为750bp。该文库的建立为该染色体特异探针的筛选、遗传图谱的构建、重要基因的克隆以及棉花基因组测序的最终完成积累了基础性研究资料。4.棉花单染色体RGA克隆。以水稻的抗病同源引物P1和P2对亚洲棉石系亚1号的第5号染色体接头介导PCR（LA-PCR）的第二次扩增池进行扩增,获得P7、P12、P19和P23等4个序列。序列比对表明,这4条序列均为NBS-LRR类棉花的抗病基因同源序列（RGA）。进一步对它们进行聚类,序列P7,P12,P19聚成很窄的一类,它们之间的同源性很高,估计它们来源于同一基因簇,P23聚成另一类,与黑松的RPS2和油菜的RGA30同源性较高。5.棉花FISH技术系统的建立。首次在棉花中探索成功高效制备DNA纤维技术,建立起一套完整的棉花FISH技术系统。该技术方便快捷,成功率高,成本低,容易被掌握和快速推广,必将为深入进行棉花基因组研究乃至棉花基因组测序的最终完成提供强有力的技术支持。6.棉花FISH技术系统的应用研究。45S rDNA在亚洲棉石系亚1号中期和粗线期染色体上有两对大的信号,在DNA纤维上信号为非连续的念珠状,多个拷贝串联排列,每个拷贝长度大约在3～11μm,推测每个拷贝的实际长度为11～30kb;端粒序列在亚洲棉石系亚1号中期和粗线期染色体端部都有双点信号,在DNA纤维上信号也为非连续的念珠状,不同染色体上信号长度大约在1～9μm不等,推测实际长度为4～27kb;gDNA信号几乎布满整个亚洲棉石系亚1号中期和粗线期染色体,在粗线期染色体上能明显区分出常染色质区和异染色质区,DNA纤维上的信号均为非连续的念珠状。Pima90的两个BAC克隆150-D-24、182-F-9在雷蒙德氏棉中期染色体上两信号中心点距离为0.21μm,在粗线期染色体上为3.8μm,在DNA纤维上荧光信号为典型的非连续的念珠状,其中150-D-24长度为32.7μm,182-F-9长度为37.9μm,两个克隆之间的距离128.4μm。按照DNA纤维伸展程度为3.27kb/μm,则150-D-24实际长度为107kb;182-F-9实际长度为124kb;两个克隆之间的实际距离为419.8kb。但DNA纤维存在着堆积和断裂,实际长度可能会更长些。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 染色体分离技术及其应用研究
• 1.1.1 染色体分离技术的基本原理
• 1.1.2 染色体分离技术的程序
• 1.1.3 染色体分离技术在植物中的应用
• 1.2 荧光原位杂交技术的发展及其在植物中的应用研究
• 1.2.1 荧光原位杂交技术的基本原理
• 1.2.2 荧光原位杂交技术的操作步骤
• 1.2.3 荧光原位杂交技术的特点
• 1.2.4 荧光原位杂交技术的发展
• 1.2.5 DNA纤维荧光原位杂交
• 1.2.6 荧光原位杂交技术在植物研究中的应用
• 1.3 荧光原位杂交技术在棉花基因组研究中的应用
• 1.3.1 基因组荧光原位杂交
• 1.3.2 BAC克隆荧光原位杂交
• 1.3.3 重复序列DNA荧光原位杂交
• 1.4 本研究的目的意义
• 第二章 棉花单染色体分离及染色体涂色研究
• 2.1 材料
• 2.1.1 棉花材料
• 2.1.2 酶和生化试剂
• 2.1.3 切割仪器耗材
• 2.1.4 实验所用SSR引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 有丝分裂中期染色体制片
• 2.2.2 有丝分裂中期染色体膜载片的制备
• 2.2.3 单染色体的显微分离
• 2.2.4 Sau 3A接头的制备及LA-PCR扩增
• 2.2.5 DOP-PCR扩增
• 2.2.6 扩增产物的琼脂糖电泳检测
• 2.2.7 Southern杂交验证
• 2.2.8 SSR引物扩增验证
• 2.2.9 荧光原位杂交验证
• 2.2.10 染色体涂色
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 中期染色体玻璃制片
• 2.3.2 中期染色体膜制片
• 2.3.3 单染色体显微分离
• 2.3.4 LA-PCR扩增产物的检测
• 2.3.5 DOP-PCR扩增产物的检测
• 2.3.6 Southern杂交验证
• 2.3.7 SSR引物扩增验证
• 2.3.8 荧光原位杂交验证
• 2.3.9 染色体涂色
• 2.4 讨论
• 2.4.1 染色体玻璃制片
• 2.4.2 染色体膜制片
• 2.4.3 单染色体显微切割
• 2.4.4 扩增产物的获得
• 2.4.5 扩增产物的验证
• 2.4.6 染色体涂色研究
• 2.5 小结
• 第三章 棉花单染色体文库的构建和RGA克隆
• 3.1 材料
• 3.1.1 棉花材料
• 3.1.2 酶和生化试剂
• 3.1.3 切割仪器耗材
• 3.1.4 质粒和载体
• 3.1.5 实验所用引物
• 3.2 方法
• 3.2.1 有丝分裂中期染色体膜载片的制备
• 3.2.2 染色体的显微分离
• 3.2.3 Sau 3A接头的制备及LA-PCR扩增
• 3.2.4 琼脂糖电泳检测
• 3.2.5 Southern杂交验证
• 3.2.6 SSR引物扩增验证
• 3.2.7 荧光原位杂交验证
• 3.2.8 单染色体文库的构建
• 3.2.9 单染色体R基因同源序列的克隆及分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 染色体膜制片的准备和目标染色体的确定
• 3.3.2 染色体的显微分离
• 3.3.3 染色体DNA的体外扩增
• 3.3.4 Southern杂交验证
• 3.3.5 SSR引物扩增验证
• 3.3.6 荧光原位杂交验证
• 3.3.7 文库的构建
• 3.3.8 文库的初步分析
• 3.3.9 R基因同源序列的扩增
• 3.3.10 Southern验证
• 3.3.11 克隆、酶切归类和测序
• 3.3.12 R基因同源序列的比较和聚类分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 染色体膜制片的制备
• 3.4.2 目标染色体的识别和显微分离
• 3.4.3 单染色体的扩增和验证
• 3.4.4 文库的构建及其分析
• 3.4.5 R基因同源序列克隆
• 3.4.6 R基因同源序列的聚类分析
• 3.5 小结
• 第四章 棉花DNA纤维FISH技术体系建立及其应用研究
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 黄化子叶的准备
• 4.1.3 细胞核的提取
• 4.1.4 DNA纤维的制备
• 4.1.5 有丝分裂中期染色体玻璃载片的制备
• 4.1.6 粗线期染色体玻璃载片的制备
• 4.1.7 45S rDNA的提取
• 4.1.8 BAC-DNA的提取
• 4.1.9 端粒序列的获得
• 4.1.10 相关探针的标记
• 4.1.11 有丝分裂中期染色体双色荧光原位杂交
• 4.1.12 粗线期染色体双色荧光原位杂交
• 4.1.13 DNA纤维双色荧光原位杂交
• 4.1.14 DNA纤维荧光原位杂交
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 细胞核的提取
• 4.2.2 DNA纤维的制备
• 4.2.3 粗线期染色体的制备
• 4.2.4 45S rDNA和BAC-DNA的提取
• 4.2.5 端粒序列的扩增
• 4.2.6 有丝分裂中期染色体双色荧光原位杂交
• 4.2.7 粗线期染色体双色荧光原位杂交
• 4.2.8 DNA纤维双色荧光原位杂交
• 4.2.9 DNA纤维荧光原位杂交
• 4.3 讨论
• 4.3.1 细胞核的提取
• 4.3.2 DNA纤维的制备
• 4.3.3 有丝分裂中期染色体双色荧光原位杂交
• 4.3.4 粗线期染色体双色荧光原位杂交
• 4.3.5 DNA纤维荧光原位杂交
• 4.3.6 DNA纤维双色荧光原位杂交
• 4.4 小结
• 第五章 全文结论
• 5.1 全文结论
• 5.2 进一步工作设想
• 参考文献
• 附录
• 附录1 测序结果
• 附录2 核苷酸比对结果
• 附录3 氨基酸序列
• 附录4 氨基酸比对结果
• 附录5 相关试剂配制
• 致谢
• 作者简介