天蓝链霉菌钙离子结合蛋白的晶体学研究和结构分析

论文摘要

钙离子在许多细胞的生理功能中都起到了十分重要的作用,包括信号转导、细胞周期调控、神经递质释放、糖元代谢,乃至细胞死亡等。在真核细胞中,Ca2+的生物调控作用是通过一类高度保守并且普遍存的多功能钙离子受体—钙调蛋白来实现的。但长期以来,一直不能确定原核生物中是否存在与真核生物同源的钙调蛋白。天蓝链霉菌Streptomyces coelicolor是一类重要的抗生素生产者,具有广泛实际用途和巨大经济价值。研究其有可能参与次级代谢的蛋白和调控机制,可为提高次级代谢产物产量和药物开发打下基础,具有潜在的经济价值和社会效益。本论文旨以S. coelicolor为研究对象,通过原核表达、纯化、结晶、X射线衍射和结构解析等技术手段,展开对天蓝链霉菌钙离子结合蛋白的晶体结构和功能关系的研究。天蓝链霉菌钙离子结合蛋白的重组蛋白能在Escherichia coli中高效可溶表达,并获得纯度较高的蛋白质,我们采用悬滴气相扩散法对结晶条件筛选和优化,最终获得了CabD适合X-射线衍射的晶体,并且收集了一套分辨率为1.5?的衍射数据。晶体空间群为P212121,晶胞参数为a=33.1?,b=51.1?,c=87.3?,α=β=γ=90°。利用单波长反常散射法解析了CabD母体结构。CabD的三维结构是一个紧密的球型分子,包含八个α-螺旋,相邻的两个α-螺旋和连接loop组成一个EF手型结构域。成对的EF手型结构域分部在蛋白分子两端,通过第92位的赖氨酸组成的结区相连接,形成一个明显的包含大约20个芳香残基的疏水核心。为进一步推测CabD可能参与的钙离子介导的生物调控作用,我们将CabD和相关的具有四个EF手型结构域的钙离子结合蛋白进行了三维结构比对。CabD分子最后一个EF手型结构域后缺少其它钙离子缓冲蛋白中普遍存在的C末端loop区,使得疏水口袋的开口处能够更容易地识别和结合假定的目标小分子。本课题对天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD的三维结构的研究,对进一步研究于原核生物中的钙信号转导奠定了结构基础,具有重要的理论意义和潜在的经济效益。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 引言
• 1.1 选题背景和意义
• 1.2 真核细胞中钙离子信号的研究进展
• 1.2.1 钙离子通道功能
• 1.2.2 钙离子信号调节酶的活性
• 1.2.3 钙离子信号与细胞运动
• 1.2.4 钙离子信号参与细胞衰老过程
• 1.3 原核细胞中钙离子主要生理功能
• 1.4 钙离子结合蛋白的功能和结构研究
• 1.4.1 钙离子结合蛋白的分类
• 1.4.2 钙调蛋白结构特性
• 1.4.3 钙调蛋白功能与分子作用机理
• 1.4.4 钙调蛋白结合蛋白
• 1.5 天蓝链霉菌中钙离子结合蛋白的研究进展
• 1.5.1 细菌中的钙离子结合蛋白
• 1.5.2 天蓝链霉菌的代谢系统
• 1.5.3 天蓝链霉菌中的钙离子结合蛋白
• 1.6 论文结构安排
• 第二章 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白的克隆、表达、纯化及生化性质分析
• 2.1 生物信息学分析
• 2.1.1 氨基酸序列理化性质分析
• 2.1.2 序列相似性及同源结构分析
• 2.1.3 与相关蛋白的序列比对分析
• 2.1.4 二级结构预测
• 2.1.5 结构域分析
• 2.1.6 生物信息学分析结论
• 2.2 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白基因的克隆及表达载体的构建
• 2.2.1 基因克隆
• 2.2.2 表达载体的构建
• 2.2.3 重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达
• 2.3 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白的纯化
• 2.3.1 CabB 的纯化
• 2.3.2 CabC 的纯化
• 2.3.3 CabD 的纯化
• 2.3.4 CabE 的纯化
• 2.4 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白的结晶
• 2.4.1 蛋白质结晶原理和方法
• 2.4.2 结晶条件的初步筛选
• 2.4.3 结晶条件的优化
• 2.4.4 硒代甲硫氨酸衍生物的晶体制备
• 第三章 数据收集与蛋白质晶体结构解析
• 3.1 数据收集
• 3.1.1 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD 母体晶体衍射数据的收集与处理.
• 3.1.2 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白 CabD 硒代衍生物晶体衍射数据的收集与处理
• 3.2 数据处理统计
• 3.3 单波长反常散射法解析天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD 母体晶体结构
• 3.3.1 求解相位问题的方法
• 3.3.2 确定并修正重原子（硒）的位置
• 3.3.3 获得初始相位
• 3.3.4 相位改善和密度修正
• 3.3.5 结构模型的搭建与精修
• 3.3.6 最终结构模型的分析
• 第四章 CabD 晶体结构分析与讨论
• 4.1 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD 母体结构分析
• 4.1.1 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD 整体结构描述
• 4.1.2 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD 的钙离子结合位点描述
• 4.1.3 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD 与同源蛋白的序列和结构比对
• 4.2 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白CabD 的生物学调控模式
• 第五章 结论
• 参考文献
• 致谢
• 附录 天蓝链霉菌钙离子结合蛋白氨基酸序列
• 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果