新疆加工番茄病毒种类鉴定和分离物XJB087的株系鉴定

论文摘要

2005 -2006年间对新疆奎屯、石河子、玛纳斯、昌吉、焉耆和博湖等加工番茄主产区进行了加工番茄病毒病的广泛调查。调查发现新疆加工番茄病毒病害各地发病率达73～91%,平均发病率为82.1%,在田间主要表现为花叶、条斑坏死、蕨叶畸形、曲叶和矮化等多种类型的症状,以花叶和坏死条斑为主,其中花叶78%,条斑37%,并且条斑症状90%以上都伴有花叶症状。在采集的221个样品中,通过RT-PCR扩增感病植株的总RNA方法来鉴定病毒的种类,鉴定结果以TMV为优势病毒种类,占86.4%;CMV次之,占28.1%,PVY也有发生,为3.2%,TMV和CMV复合浸染17.6%。另外,调查显示新疆加工番茄病毒病的发生率与栽培措施有一定的关系。从新疆博湖县花叶症状的加工番茄病株中,获得了病毒分离物XJB087,经过症状观察和RT-PCR扩增,证实病毒分离物XJB087是马铃薯Y病毒的一个株系。对病毒分离物XJB087的外壳蛋白基因进行了克隆和序列分析,以提取的RNA为模板,应用RT-PCR扩增,PCR产物克隆到质粒PMD20-T上并序列分析。结果表明,克隆基因的片段由801个核苷酸组成,编码267个氨基酸。与基因库中PVY代表株系相比,结果核苷酸序列与PVYN,PVYO, PVYMN,PVYNTN,的同源率分别为97.1%、98.1%、89.8%、89.9%;氨基酸序列与PVYO,PVYN,PVYMN,PVYNTN的同源率分别为97.3%、98.9%、92.5%、92.1%。通过进化树分析表明XJB087与PVYN株系亲缘关系最近,确定XJB087归于马铃薯Y病毒坏死株系（ PVYN株系）。根据GENEBANK中的PVY辅助蛋白基因（HC-Pro）序列设计引物,对病毒分离物XJB087进行了RT-PCR扩增,结果扩增出与预期目标大小相同的片段。通过克隆测序,与基因库中不同代表PVY株系的HC-Pro进行比较,经过进化树分析,与PVYN同源性最高,其中核苷酸同源性为94%,氨基酸同源性92%,进一步证明了PVY加工番茄分离物为PVYN株系。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 主要符号表
• 前言
• 第一章 文献综述
• 1.1 番茄主要病毒病发生概况
• 1.2 马铃薯Y 病毒研究概况
• 1.2.1 PVY 的基因组结构及功能
• 1.2.2 PVY 株系划分的研究
• 1.2.3 PVY 病毒的侵染和传播
• 1.3 加工番茄病毒病害的病毒主要检测方法
• 1.3.1 生物学检测法
• 1.3.2 电子显微镜检测技术
• 1.3.3 血清学方法
• 1.3.3.1 琼脂双扩散试验
• 1.3.3.2 酶联免疫吸附法（ELISA）
• 1.3.4 dsRNA 技术
• 1.3.5 基本分子生物学方法
• 1.3.5.1 核酸杂交技术
• 1.3.5.2 RT-PCR 技术
• 1.3.5.3 基因芯片技术
• 第二章 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 毒原
• 2.1.2 质粒和载体
• 2.1.3 酶及试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 引物
• 2.2 方法
• 2.2.1 毒源的采集
• 2.2.2 毒源的分离
• 2.2.3 病毒分离物XJ8087 的生物学测定
• 2.2.4 病毒分离物XJ8087 的侵染性试验
• 2.2.5 病毒分离物XJ8087 的分子鉴定
• 2.2.5.1 病原病毒总RNA 的提取
• 2.2.5.2 PCR 检测体系的建立及其优化
• 2.2.5.3 DNA 片段的回收纯化
• 2.2.5.4 重组质粒的构建
• 2.2.5.5 感受态细胞制备及重组质粒的转化
• 2.2.5.6 重组质粒的抽提
• 2.2.5.7 重组质粒的菌落PCR 鉴定及酶切鉴定
• 2.2.5.8 PCR 产物序列测定
• 2.2.5.9 PCR 产物DNA 序列同源性比较
• 第三章 结果与分析
• 3.1 新疆加工番茄病毒病害的发生与危害
• 3.1.1 症状类型及发病率
• 3.1.2 加工番茄播期与病毒病发生
• 3.1.3 加工番茄重茬连作与病毒病的发生
• 3.1.4 加工番茄病毒种类的鉴定
• 3.2 病毒分离物XJ8087 的鉴定及其序列分析
• 3.2.1 病毒分离物XJ8087 在几种寄主上的反应症状
• 3.2.2 侵染性试验
• 3.2.3 病毒分离物XJ8087 的RT-PCR 鉴定
• 3.2.4 病毒分离物XJ8087 CP 基因的克隆及鉴定
• 3.2.5 病毒分离物XJ8087 CP 基因的序列测定和分析
• 3.3 XJ8087 分离物HC-PRO 基因的扩增、克隆和序列分析
• 3.3.1 XJ8087 分离物HC-PRO 基因的RT-PCR 扩增
• 3.3.2 XJ8087 分离物HC-PRO 基因克隆
• 3.3.3 XJ8087 分离物HC-PRO 基因序列分析
• 第四章 结论与讨论
• 参考文献
• 附录 常用缓冲液及培养基配方
• 致谢
• 作者简介
• 导师评阅表