利用RNAi提高烟草对病毒的抗性及岷江百合遗传转化体系的初步构建

论文摘要

在农业生产中,病毒病害是仅次于真菌的第二大病害,每年对农业经济造成了巨大的损失。传统的病毒病防治措施主要包括：（1）农业的综合防治；（2）弱毒株系交叉保护防治植物病毒；（3）施用化学农药。这些方法都存在一些局限性和弊端,不能从根本上解决病毒病害问题。目前,随着植物基因工程技术的发展,基因沉默已发展为防治植物病毒病害的重要措施。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是由双链RNA （double-stranded RNA, dsRNA）引起的序列特异性基因沉默,可以调节和关闭基因的表达,进而调控细胞的各种高级生命活动。RNAi普遍存在于真核生物中,是植物应对外来病毒入侵的一种防御机制,在同一个启动子后面同时克隆目标基因的正义序列与反义序列,中间用一个内含子隔开。转录后的RNA自我配对形成一个反向重复序列,即发夹RNA （hairpin RNA, hpRNA）结构,发夹茎部能够形成稳定的dsRNA可诱导发生基因沉默。黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）属于典型的三分体正义单链RNA病毒。CMV是危害最严重的病毒之一,具有重要的研究价值。本研究首先从云南省呈贡县采集带病毒症状的百合病叶,通过RT-PCR扩增获得CMV RNA1及RNA2的部分基因片段,并进行测序。其中扩增的1α基因片段长344bp,2α基因片段长308bp,序列比对表明,克隆的基因分别与CMV1a及2α高度同源。本研究采用高通量表达载体pHellsgate2,利用带有attB接头的引物对CMV1a及2α基因片段进行PCR,并通过BP反应将PCR产物构建pHellsgate2载体上。利用电转化法将RNAi表达载体转入农杆菌LBA 4404,经过农杆菌介导的遗传转化法将RNAi载体转入烟草中并表达。基因组DNA PCR检测得到CMV 1a转基因烟草阳性株41株,CMV 2a转基因烟草阳性株132株。以转基因阳性株为材料,进行CMV抗性分析。实验结果表明,1α及2a RNAi载体转基因烟草对CMV的抗性较野生型明显增强。接种CMV的野生型烟草叶片出现扭曲,失去光泽,叶色浓淡不均,并出现黄绿相间的花叶症状,而转基因烟草叶片个别表现轻微的花叶症状,大部分没有CMV感染的症状。经过RT-PCR检测,20株1a RNAi载体转基因烟草中,有12株表现出CMV抗性,而接种CMV的40株2a RNAi载体转基因烟草中,有21株表现出CMV抗性。这说明CMV 1a和2α双链RNA在烟草中的表达使转基因烟草对CMV侵染产生了不同程度的抗性。岷江百合（Lilium regale）又名王百合,是我国特有品种。岷江百合的抗逆性很强,是很好的遗传育种资源。本研究初步建立了根癌农杆菌介导的岷江百合遗传转化方法。本实验通过GUS基因的瞬时表达,对农杆菌介导的岷江百合遗传转化体系参数进行了优化。最终确定岷江百合的最优转化参数为：农杆菌的最适菌液浓度OD600为1.0,侵染时间为25-30min;共培养时温度为23℃；共培养时间为48h；共培养基中AS浓度为100mg/L,去NH4NO3。在瞬时表达的基础上进行了稳定表达,进一步摸索了岷江百合的遗传转化体系。在检测的36株转基因岷江百合中,有31株为阳性。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 插图和附表清单
• 缩略词
• 第一章 文献综述
• 1.1 植物病毒病的研究进展
• 1.1.1 植物病毒病的危害
• 1.1.2 病毒侵染机制
• 1.1.3 黄瓜花叶病毒
• 1.1.4 植物病毒病的主要防治方法
• 1.2 RNAi在植物抗病毒应用中的研究进展
• 1.2.1 RNAi的机制
• 1.2.2 病毒抑制PTGS的作用方式
• 1.2.3 dsRNA引发的基因沉默
• 1.2.4 RNAi技术的应用
• 1.3 百合遗传转化的研究进展
• 1.3.1 百合组织培养
• 1.3.2 农杆菌介导的遗传转化
• 1.3.3 GUS与NPTII在遗传转化中的应用
• 1.3.4 植物基因工程在百合上的应用
• 1.4 本课题的研究意义与目的
• 第二章 CMV复制酶基因1α及2α的分子克隆及RNAi载体的构建
• 2.1 前言
• 2.2 材料
• 2.2.1 病毒材料
• 2.2.2 菌株和载体
• 2.2.3 主要试剂
• 2.2.4 缓冲液配方
• 2.3 方法
• 2.3.1 百合病叶组织RNA提取及纯化
• 2.3.2 cDNA逆转录
• 2.3.3 PCR反应
• 2.3.4 T-A克隆
• 2.3.5 大肠杆菌感受态细胞的热刺激转化
• 2.3.6 琼脂糖凝胶电泳
• 2.3.7 SDS碱裂解法提取并纯化质粒
• 2.3.8 PMD-18T-CMV1α及2α的PCR检测
• 2.3.9 BP重组反应
• 2.3.10 RNAi载体的酶切检测
• 2.3.11 制备农杆菌感受态细胞
• 2.3.12 电转化法转化农杆菌感受态细胞
• 2.2.13 PCR检测
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 CMV复制酶基因1α和2α的克隆
• 2.4.2 核苷酸序列的同源性分析
• 2.4.3 RNAi载体的构建
• 2.4.4 RNAi植物表达载体转化农杆菌
• 2.5 讨论
• 第三章 遗传转化及CMV抗性分析
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 植物材料
• 3.2.2 主要试剂
• 3.2.3 CMV材料
• 3.2.4 缓冲液和培养液配方
• 3.3 方法
• 3.3.1 遗传转化
• 3.3.2 CTAB法提取植物总DNA
• 3.3.3 引物设计
• 3.3.4 PCR检测
• 3.3.5 黄瓜花叶病毒粗提液的制备
• 3.3.6 转基因植株接种病毒
• 3.3.7 RNA的提取
• 3.3.8 RT-PCR检测
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 转基因植物的PCR检测
• 3.4.2 转基因烟草接种病毒
• 3.5 讨论
• 第四章 岷江百合遗传转化体系的初步建立
• 4.1 前言
• 4.2 材料和试剂
• 4.2.1 植物材料
• 4.2.2 菌株和载体
• 4.2.3 主要试剂
• 4.2.4 缓冲液和培养基配方
• 4.3 方法
• 4.3.1 GUS染色
• 4.3.2 岷江百合农杆菌侵染参数的优化
• 4.3.3 CTAB法提取岷江百合基因组DNA
• 4.3.4 引物设计
• 4.3.5 PCR反应
• 4.4 结果与分析
• 4.4.1 农杆菌侵染参数的优化
• 4.4.2 转基因岷江百合的的基因组PCR检测
• 4.5 讨论
• 第五章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录A 攻读硕士期间发表论文目录