论文摘要
磷是作物生长所必需的大量元素之一,而土壤中80%以上的磷元素以作物较难利用的难溶性磷的形式存在。土壤根际微生态环境中的解磷菌（phosphate solubilizing bacteria, PSB）可将难溶性磷源转化为可溶性磷源。近年来随着绿色农业的兴起,解磷菌逐渐被应用于农业领域。本文从土壤中筛选一株高效解磷菌,考察其解磷特征,优化发酵工艺并对其盆栽应用效果进行评价,为微生物肥料的开发和应用奠定基础。本文采用难溶性磷为培养基唯一磷源的逐级筛菌方法,从武汉郊区植物根际土壤筛选解磷菌,获得一株具有高效解有机和无机难溶性磷的解磷菌L13,通过生理生化特征分析和16s rDNA序列比对将其鉴定为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）,其对植酸钙的解磷量可达208.27mg/L,对Ca3（PO4）2的解磷量可达449.03mg/L。进一步考察了恶臭假单胞菌L13在改良Pikovskaya （PKO）液体培养基中的解磷特征,结果发现解磷量的变化与菌体的生长呈现出较好的相关性（p<0.05）植酸酶主要在对数生长期产生；发酵液中主要含有草酸、乳酸、α-酮戊二酸和富马酸4种已知有机酸；pH值在发酵2d下降到4.0后保持稳定。推测恶臭假单胞菌L13对难溶性磷的溶解作用在对数生长期以植酸酶和有机酸为主,而在平稳期发酵液中大量释放的H+起主导作用,而衰亡期伴随菌体的自溶也会向胞外释放部分可溶性磷。以提高恶臭假单胞菌L13生物量为目标,在摇瓶水平上用BBD响应面和单因素法分别优化其培养基配方和培养条件,并在3L发酵罐中进行了验证。得到优化的培养基配方为：葡萄糖17.64 g/L,酵母粉2.39 g/L, （NH4）2SO41.41 g/L,磷酸缓冲盐101.53%, MgSO4-7H2O 0.3 g/L, KC10.1g/L;培养条件为：起始pH 7.3,接种量0.5%,培养温度28℃,装液量30 mL/250 mL。优化后恶臭假单胞菌L13生物量提高了16.70倍,活菌数达到105.73×108CFU/mL,有效解决了解磷微生物在葡萄糖培养基中生物量普遍不高及贴壁生长的问题。分别以草炭、麸皮、油菜籽粉和米糠作为固体菌剂载体,考察恶臭假单胞菌L13的存活情况。结果发现恶臭假单胞菌L13以草炭作为载体其存活效果最好。经过90d的考察,菌剂无霉菌污染,细菌杂菌数<30%,且每克菌剂中恶臭假单胞菌L13的活菌数在1×108CFU以上在玉米催芽促生根试验中发现恶臭假单胞菌L13的5倍纯菌稀释液对种子发芽率效果较好,与对照相比提高了30%,而其发酵液稀释液对种子根长和生根数也显示了较好的促进效果。将恶臭假单胞菌L13接种到施有腐熟猪粪和三种无机磷肥的盆栽玉米根际,考察了该菌与有机磷肥和无机磷肥搭配施用效果。结果发现在玉米生长的不同时期以猪粪为基肥的土壤可溶性磷和磷酸酶酶活都显著高于对照,植酸酶酶活在前14d接菌处理显著高于对照,之后差异不再显著。玉米收获后,接菌处理的玉米的株高、茎粗、根长、鲜重、干重以及玉米叶片全磷含量与对照相比都有显著提高。使用3种无机磷肥与恶臭假单胞菌L13搭配使用,对玉米的促生长效果为磷酸二氢钙>磷矿粉>磷酸三钙。磷矿粉效果虽略低于磷酸二氢钙,但成本低廉,建议在大田试验中使用磷矿粉作为磷肥基肥与恶臭假单胞菌L13搭配使用。