应用骨髓基质干细胞和胶原—壳聚糖复合支架体外构建组织工程心脏瓣膜的初步实验研究

论文摘要

目的：探讨用BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞，以胶原-壳聚糖复合物为支架材料，运用组织工程学的原理和方法体外构建组织工程心脏瓣膜的可行性。 方法：无菌条件下获得兔骨髓液，贴壁培养法分离BMSCs，DMEM培养液体外培养、扩增、诱导分化为内皮细胞，并行内皮细胞鉴定；组织块培养法体外分离、培养、扩增兔主动脉壁成纤维细胞、平滑肌细胞，并行成纤维、平滑肌细胞鉴定；将成纤维、平滑肌细胞与内皮细胞按顺序种植在预湿处理的胶原-壳聚糖复合支架上，体外培养观察，同时将支架材料移植入新西兰大白兔背阔肌表面，定期取出检查。通过组织学及倒置显微镜、扫描电镜观察内皮细胞在体内支架上粘附、增殖、生长和基质分泌情况及材料的组织相溶性和体内降解情况。 结果：1．胶原-壳聚糖复合材料具有良好的亲水性和细胞亲和力，皮内埋置实验显示生物相容性好，体内降解时间为8～10周；2．骨髓细胞基质干细胞（BMSCs）贴壁生长，在生长因子等诱导下可分化为内皮细胞，细胞生长曲线良好。组织块培养法体外成功分离、培养、扩增兔主动脉壁成纤维细胞、平滑肌细胞；3．以成纤维、平滑肌细胞和内皮细胞为种子细胞，以胶原-壳聚糖复合材料为支架，体外可以构建TEHV：HE示内皮细胞能够在胶原-壳聚糖复合支架上粘附、伸展、增殖并分泌基质，在TEHV表面长成一连续细胞层；SEM示TEHV表面光滑，细胞生长良好，细胞层完整。且瓣膜表面的内皮细胞具有合成和分泌前列环素（PGI2）的功能。 结论：以主动脉壁体外分离、培养、传代的平滑肌、成纤维细胞和BMSCs诱导分化的内皮细胞为种子细胞，依次种植在胶原-壳聚糖复合支架上可以构建TEHV，且内皮细胞能够分泌PGI2。

论文目录

• 英语缩略表
• 中文摘要
• 英文摘要
• 引言
• 第一部分 胶原-壳聚糖复合支架的制备和性能检测
• 一 材料和方法
• （一） 材料
• （二） 试剂
• （三） 仪器
• （四） 方法
• 二 结果
• （一） 胶原蛋白的提取办法
• （二） 胶原蛋白的定性分析-紫外光谱分析
• （三） 胶原-壳聚糖的结构特性观察
• （四） HE染色和Masson染色
• （五） 扫描电镜观察
• （六） 生物相容性实验（胶原-壳聚糖多孔支架皮下埋植实验）
• （七） 体内降解性实验
• 三 讨论
• 四 结论
• 第二部分 种子细胞的获取和鉴定
• 一 内皮细胞的获取和鉴定
• （一） 材料和方法
• （二） 结果
• （三） 讨论
• （四） 结论
• 二 平滑肌细胞、成纤维细胞的获取和鉴定
• （一） 材料和方法
• （二） 结果
• （三） 讨论
• （四） 结论
• 第三部分 组织工程心脏瓣膜的构建
• 一 材料和方法
• 二 结果
• （一） 材料接种细胞后的光镜观察（图53-图59）
• （二） 体外培养10d时的各项检查结果
• （三） 放免法检测培养液中内皮细胞分泌的6-keto-PGF1a的含量
• 三 讨论
• （一） 平滑肌细胞、成纤维细胞和内皮细胞种植的必要性
• （二） 细胞种植
• （三） 细胞种植效率的提高、细胞粘附和生长
• （四） 瓣膜构建实验研究
• 四. 结论
• 总论
• 参考文献
• 致谢
• 综述
• 瓣膜组织工程的构建进展
• 已发表的文章