黑龙江林蛙皮抗菌肽dybowskin-2CAMa的表达及抗菌活性的初步研究

论文摘要

抗菌肽（antibacterial peptides, ABP）又称抗微生物肽（antimicrobial peptides, AMP）或肽抗生素（peptide antibiotics）,是生物机体为对抗外源性病原体及恶性细胞,由免疫防御系统非专一性应答产生的一类小分子活性肽类的总称。抗菌肽通常是由10-50个氨基酸组成的小分子多肽,具有抗菌谱广、热稳定性强、分子量小及免疫原性小等特点,其杀菌机制独特,不易产生耐药菌,有望开发为新一代肽类抗生素。两栖类动物的生活环境复杂多样,而且皮肤湿润、裸露,与各种微生物密切接触,为外界微生物的入侵创造了便利条件。它们依靠皮肤腺体分泌出一系列抗菌肽,防御外界病原菌的侵袭。蛙科（Ranidae）是无尾目的第三大科,其分布几乎遍及各大洲,其皮肤抗菌肽的种类和数量极其惊人,这意味着对其进行研究有着巨大的价值。在本实验室前期工作中,获得了一系列黑龙江林蛙皮肤抗菌肽的cDNA序列,将其中的一条命名为dybowskin-2CAMa。该肽是一新型肽,不同于已报道的蛙类抗菌肽,除序列特异性外,还具有正电荷多、等电点高、亲水性强等特点。其结构预测分析以及氨基酸分布显示,dybowskin-2CAMa为一类对细菌膜有高亲和性的阳离子α-螺旋抗菌肽,推测其可能具有较强的抗菌活性。为进一步了解新型肽D-2CDYb的生物学特性,本实验根据抗菌肽dybowskin-2CAMa的基因序列,考虑毕赤酵母偏好性,成熟肽A+T的含量及成熟肽N末端与信号肽序列的一致性等因素设计四条引物,利用SOE-PCR方法获得dybowskin-2CAMa全长基因,连接到酵母分泌型表达载体pPICZαA,构建了pPICZαA-dybowskin-2CAMa毕赤酵母重组表达质粒,重组质粒经SacI酶切线性化后,电转化巴斯德毕赤酵母X33,构建真核表达体系,筛选出了抗Zecoin 2000μg/mL的转化子,然后用PCR方法鉴定重组菌株。阳性转化子经甲醇诱导表达后,提取酵母细胞总基因组,利用α-factor引物、3’AOX引物其进行扩增,获得300bp左右的扩增产物,与目的基因dybowskin-2CAMa大小吻合,说明目的基因已插入宿主染色体中。提取经诱导表达后的酵母细胞总RNA后,通过RT-PCR的方法验证,结果说明抗菌肽dybowskin-2CAMa的基因已转录。有活性的发酵液上清通过YMC﹡GEL ODS-A和SephadexTM G-25 Fine凝胶柱层析获得dybowskin-2CAMa纯品,纯品经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDE-TOF-MS）分析,分子量与dybowskin-2CAMa分子量一致,通过抑菌试验和溶血试验,显示重组抗菌肽dybowskin-2CAMa对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制活性,且对革兰氏阳性细菌的抑制作用比对革兰氏阴性细菌的抑制作用强,对耐药株大肠杆菌EBSL的最小抑菌浓度为4μg/mL,并且在浓度为500μg/mL时,没有溶血现象。本文研究结论:利用巴斯德毕赤酵母表达体系能够正确表达黑龙江林蛙皮肤抗菌肽dybowskin-2CAMa基因。重组抗菌肽dybowskin-2CAMa对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）,革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）均有抑制活性,且对革兰氏阳性细菌的抑制作用比对革兰氏阴性细菌的抑制作用强,对耐药株大肠杆菌EBSL的最小抑菌浓度为4μg/mL,并且在浓度为500μg/mL时,没有溶血现象。本研究为进一步研究抗菌肽dybowskin-2CAMa的杀菌及抑瘤的作用机理提供了稳定的样品来源。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 0.1 概述
• 0.1.1 抗菌肽的分类及结构特点
• 0.1.2 抗菌肽的作用机制
• 0.1.3 对正常的真核细胞无作用的原因
• 0.2 蛙科两栖类动物皮肤抗菌肽研究进展
• 0.2.1 主要特征与近来发现的抗菌肽
• 0.2.2 抗菌活性和其他的生物学活性
• 0.2.3 抗菌肽运输机制和在生物技术方面的应用
• 0.3 毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略
• 0.3.1 遗传因素
• 0.3.2 培养条件的影响
• 0.3.3 重组菌株及目的蛋白的检测分析
• 0.4 本文研究的目的和意义
• 第1章 抗菌肽dybowskin-2CAMa密码子优化及重组酵母表达载体的构建
• 1.1 引言
• 1.2 材料
• 1.2.1 菌种和载体
• 1.2.2 工具酶与生化试剂
• 1.2.3 主要仪器和设备
• 1.2.4 溶液与培养基的配制
• 1.3 方法
• 1.3.1 实验思路
• 1.3.2 引物设计
• 1.3.3 SOE-PCR 法扩增dybowskin-2CAMa 成熟肽序列
• 1.3.4 重组酵母表达载体的构建
• 1.3.5 阳性重组质粒的测序与分析
• 1.4 结果
• 1.4.1 dybowskin-2CAMa 成熟肽基因序列的获得
• 1.4.2 dybowskin-2CAMa 及pPICZα-A 的酶切结果
• 1.4.3 阳性重组质粒的PCR 筛选结果
• 1.4.4 阳性重组质粒的测序结果
• 1.5 讨论
• 第2章 抗菌肽dybowskin-2CAMa在毕赤酵母中的表达与发酵液上清抑菌活性的检测
• 2.1 引言
• 2.2 材料
• 2.2.1 实验菌种
• 2.2.2 工具酶与生化试剂
• 2.2.3 主要仪器和设备
• 2.2.4 溶液与培养基的配制
• 2.3 方法
• 2.3.1 转化酵母菌的线性质粒制备
• 2.3.2 酵母感受态细胞的制备
• 2.3.3 线性化质粒转化毕赤酵母X33
• 2.3.4 高拷贝转化子的筛选
• 2.3.5 酵母转化子的鉴定
• 2.3.6 阳性转化子的诱导表达
• 2.3.7 目的基因的mRNA 水平的检测
• 2.3.8 Trincin-SDS-PAGE 对重组蛋白表达时间的优化
• 2.3.9 发酵上清液的抑菌活性检测
• 2.4 结果
• 2.4.1 重组质粒线性化结果
• 2.4.2 高拷贝酵母转化子的筛选及鉴定
• 2.4.3 阳性转化子mRNA 水平
• 2.4.4 Trincin-SDS-PAGE 对重组蛋白表达时间的优化
• 2.4.5 表达产物抑菌活性检测
• 2.5 讨论
• 第3章 抗菌肽dybowskin-2CAMa的初步分离纯化和抑菌活性的初步研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料
• 3.2.1 实验菌种
• 3.2.2 实验试剂
• 3.2.3 主要仪器
• 3.2.4 溶液与培养基的配制
• 3.3 方法
• 3.3.1 高拷贝重组酵母菌X33 工业盐FM21 培养基摇瓶诱导表达
• 3.3.2 发酵液上清的处理
• 3.3.3 发酵液中蛋白含量测定
• 3.3.4 抗菌肽dybowskin-2CAMa 发酵液的初步分离纯化
• 3.3.5 纯化粗品的质谱分析
• 3.3.6 抗菌肽dybowskin-2CAMa 的体外抗菌活性鉴定
• 3.3.7 抗菌肽dybowskin-2CAMa 的最小抑菌浓度（MIC）测定
• 3.4 结果
• 3.4.1 工业盐培养基FM21 诱导发酵结果
• 3.4.2 发酵液中蛋白含量测定
• 3.4.3 抗菌肽dybowskin-2CAMa 发酵液的初步分离纯化的结果
• 3.4.4 纯化粗品的质谱分析的结果
• 3.4.5 抗菌肽 dybowskin-2CAMa 的体外抗菌活性鉴定的结果
• 3.4.6 抗菌肽 dybowskin-2CAMa 的 MIC 测定结果
• 3.4.7 抗菌肽 dybowskin-2CAMa 溶血活性结果
• 3.5 讨论
• 第4章 结论
• 致谢
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文及参加科研情况