论文摘要
本研究的目的是建立利用实时定量PCR（RQ-PCR）检测血标本中肠道菌DNA的方法并对临床标本进行初步检测，并建立RQ-PCR快速检测肠道菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素敏感性的方法，以期能初步了解外科发热患者中肠道菌菌血症的现状，并建立快速药敏方法以便有利于指导治疗。在论文第一部分中，选择脆弱拟杆菌谷氨酰胺合成酶基因作为靶基因设计引物和TaqMan探针，建立20μl的RQ-PCR反应体系，采用含靶基因特异性扩增片段的重组质粒建立标准曲线，并采用High Pure PCR Template Preparation Kit提取基因组DNA，建立实时定量PCR检测血标本中脆弱拟菌DNA的方法学，并对32份外科发热患者的标本进行了临床验证。结果显示引物和探针特异性好，检测灵敏度为10°拷贝／μl（103CFU／ml），标准曲线相关系数在0.985～0.999之间。不同浓度的脆弱拟杆菌样本检测的平均准确性为（107.30±2.11）％；批内及批间重复性平均变异系数（CV）分别为（18.44±1.16）％和（19.00±4.47）％。血标本中脆弱拟杆菌DNA平均提取效率为（60.13±5.66）％，提取效率平均变异系数为（15.62±2.47）％。含有同等量脆弱拟杆菌的临床血标本存放在-20℃或-70℃6个月内，脆弱拟杆菌DNA拷贝数差异无显著性（P=0.467～0.840），该方法可用于临床标本的脆弱拟杆菌DNA检测，并具有快速、灵敏、特异、重复性好的优点。论文第二部分，采用此方法学对32例外科发热患者的84份血标本进行了实时定量PCR检测。结果显示10个标本检测到脆弱拟杆菌，阳性率约为11.90％，含量约1.78～9.24×103CFU／ml，所有患者的血培养结果均为脆弱拟杆菌阴性。论文第三部分，在含有相同浓度大肠杆菌的LB液体培养基和血中，分组加入不同的抗生素，并设立生长对照，分别培养1、2、3、4小时后提取标本的基因组DNA，以本研究组先前建立的实时定量PCR检测大肠埃希菌DNA的方法，对标本进行检测，观察不同抗生素组和生长对照组的生长曲线，来判定药敏结果，并与纸片法进行比较。结果显示实时定量PCR检测大肠埃希菌在LB液体培养基和健康人全血中对抗生素的药物敏感性，结果与常规纸片法一致，但更快速。综合研究结果显示，实时定量PCR技术不仅可用于定量检测患者血中的肠道菌，检出率及速度高于血培养；同时可用于对血中的肠道菌进行快速、准确的药物敏感性试验。
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