家蝇幼虫凝集素诱导乳腺癌细胞凋亡机理的研究

论文摘要

近年来,癌症发病率逐年增高,治疗方法的研究日益被世界所重视。本实验的目的是从家蝇幼虫体内分离纯化出具有抗肿瘤活性的凝集素,考察其对乳腺癌细胞的抑制作用,研究对肿瘤细胞作用机理。为家蝇体内活性物质的开发应用提供有力的科学依据,也为新型药物的研制提供新的物质。凝集素是一类非免疫原的糖蛋白,具有凝集细胞和沉淀多糖的能力。凝集素,普遍存在于许多物种和高等生物的组织中,其中部分凝集素还具有抗肿瘤活性。利用亲和层析方法,从家蝇幼虫体内分离出一种凝集素,其分子量为38kDa。经MTT检测,90μg/mL的凝集素可明显抑制肿瘤细胞增殖,而对正常细胞则无明显的抑制作用。AO/EB和Hochest/PI染色后,经共聚焦显微镜观察,能观察到典型的凋亡形态,即染色质浓缩,表明凝集素与细胞凋亡有关。该凝集素诱导MCF-7细胞中活性氧（ROS）发生积累,导致线粒体通透性转换孔（PTP）开放,线粒体膜电位（△ψm）随着时间的延长逐渐降低,线粒体中的细胞色素C从线粒体通透性转换孔中释放到胞浆中。此外,钙离子（Ca2+）的变化可调节凝集素诱导的MCF-7细胞凋亡,并受活性氧积累的调控。免疫印迹实验结果表明,JNK蛋白的表达量在MCF-7细胞中发生上调,且JNK依赖于活性氧的调控；流式细胞仪数据显示,加入JNK的抑制剂SP600125后,凋亡率由15.5%下降到7.45%,表明这种抑制剂能抑制MCF-7细胞的增殖,因此,JNK参与了凝集素诱导细胞的凋亡过程。随后凝集素使Bax和Bcl-2的表达发生变化,Bax与Bcl-2蛋白的表达比例升高,细胞色素C释放,Caspase被激活,cleaved-caspase-9和cleaved-caspase-6表达量升高,LaminA裂解。综上所述,凝集素诱导MCF-7细胞凋亡是通过ROS-JNK介导的Caspase和ROS-PTP途径。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 目录
• 1 前言
• 1.1 肿瘤
• 1.1.1 肿瘤及其危害
• 1.1.2 乳腺癌细胞MCF-7对人类的威胁
• 1.1.3 肿瘤的治疗
• 1.2 细胞凋亡概述
• 1.2.1 凋亡途径
• 1.2.2 活性氧与细胞凋亡
• 1.2.3 MAPK与凋亡
• 1.2.4 钙离子与细胞凋亡
• 1.2.5 线粒体在凋亡中的作用
• 1.2.6 活性氧、钙离子及线粒体通透性转换孔三者关系
• 1.2.7 线粒体通透性转换孔与线粒体膜电位关系
• 1.3 家蝇
• 1.3.1 家蝇的定义
• 1.3.2 家蝇的营养价值
• 1.3.3 家蝇的开发前景
• 1.4 凝集素
• 1.4.1 凝集素简介
• 1.4.2 凝集素的分类
• 1.4.3 凝集素生物活性与应用
• 1.5 本论文的研究目的及意义
• 1.6 本论文的研究内容
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 肿瘤细胞株与实验动物
• 2.1.2 主要药品
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.1.4 主要溶液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 家蝇的饲养
• 2.2.2 凝集素的制备
• 2.2.3 凝集素分子量的测定
• 2.2.4 人乳腺癌细胞体外增殖抑制
• 2.2.5 凝集素抗肿瘤形态学观察
• 2.2.6 流式细胞术（FCM）分析细胞凋亡
• 2.2.7 细胞内生理变化
• 2.2.8 免疫印迹检测蛋白表达变化
• 2.2.9 数据处理
• 3 结果与讨论
• 3.1 家蝇幼虫凝集素的分离纯化
• 3.1.1 凝集素亲和层析
• 3.1.2 凝集素的聚丙烯凝胶电泳测定
• 3.2 MLL-1诱导MCF-7细胞凋亡
• 3.2.1 MLL-1对MCF-7细胞和L-02细胞体外增殖抑制实验（MTT）
• 3.2.2 细胞形态学观察
• 3.3 线粒体通透转换孔（permeability transition pore PTP）与MCF-7细胞凋亡
• 3.3.1 活性氧（ROS）在MLL-1诱导的MCF-7细胞凋亡中的作用
• 2+)在MLL-1诱导的MCF-7细胞凋亡中的作用'>3.3.2 钙离子(Ca²⁺)在MLL-1诱导的MCF-7细胞凋亡中的作用
• 2+的相互关系'>3.3.3 ROS与Ca²⁺的相互关系
• 3.3.4 检测线粒体通透转换孔（PTP）的开放
• 3.3.5 环孢菌素A（CsA）对线粒体通透转换孔（PTP）开放的抑制作用
• 2+)在线粒体PTP开放中的作用'>3.3.6 活性氧（ROS）、钙离子(Ca²⁺)在线粒体PTP开放中的作用
• 3.3.7 线粒体膜电位在MLL-1诱导MCF-7细胞凋亡中的作用及与线粒体PTP的关系
• 3.3.8 MCF-7细胞线粒体细胞色素C释放
• 3.4 MAPK家族成员在MLL-1诱导MCF-7细胞凋亡途经中的作用
• 3.5 Bcl-2家族成员对MLL-1诱导MCF-7细胞凋亡的影响及其与ROS/JNK的关系
• 3.6 线粒体细胞色素C释放与ROS/JNK的关系
• 3.7 Caspase家族成员在MLL-1诱导MCF-7细胞凋亡过程中的作用
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 攻读研究生学位期间论文发表情况
• 8 致谢