人工感染传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白质组学分析

论文摘要

冠状病毒具有广泛的宿主范围,能够导致人和多种动物出现不同程度的呼吸道、肠道和神经系统的功能紊乱症状。2003年春季SARS-CoV的出现及其感染并导致的高死亡率引起了人们对冠状病毒的高度重视。对冠状病毒的致病性以及致病机理的研究是当前研究者关注的热点之一。IBV属于γ冠状病毒,主要在家禽的气管、肾脏、腺胃和生殖道等器官组织的上皮细胞中复制。IBV的传播给全球家禽业带来严重的经济损失。已有的研究证明部分其他冠状病毒的感染能够影响宿主细胞的蛋白表达模式。本研究首次利用蛋白质组学以及相关的分子生物学技术对人工感染IBV鸡胚的气管和肾脏组织的差异表达蛋白质、人工感染不同毒力IBV后不同阶段的鸡气管和肾脏组织的差异表达蛋白质进行了鉴定,并应用生物信息学工具对差异表达蛋白质的分子功能、生物学进程和亚细胞分布进行分类,旨在从蛋白质水平上探索IBV与宿主的相互作用以及IBV的致病机制。本研究首先利用双向凝胶电泳（2-DE）结合质谱技术对人工感染IBV H120疫苗株72小时时鸡胚和未感染对照组鸡胚气管和肾脏组织的群体蛋白质表达情况进行了分析。鉴定出了一些有显著差异表达的蛋白质。生物信息学分析表明这些蛋白质大多与细胞骨架组成、钙离子结合、能量代谢、抗氧化、应激反应、以及大分子物质合成有关,其中有些蛋白还具有调节细胞凋亡的特性。应用荧光定量PCR技术对热休克蛋白beta-1、胞外脂肪酸结合蛋白、原肌球蛋白alpha-1、膜联蛋白A5、过氧化物还原酶-1、膜联蛋白A2、烯醇酶-1等11种蛋白的转录水平进行了分析,结果表明这些蛋白基因的mRNA水平变化趋势和2-DE结果基本一致。Western blot分析进一步验证了热休克蛋白beta-1和膜联蛋白A5的表达变化,结果与mRNA表达模式的变化也一致。本研究着重应用2-DE和荧光差异显示双向凝胶电泳（2-DIGE）结合质谱技术研究了人工感染IBV强毒株ck/CH/LDL/97I P5和其鸡胚传代致弱毒株ck/CH/LDL/97I P115后不同时间点鸡气管和肾脏组织群体蛋白质的表达改变情况,鉴定出62种差异表达蛋白。生物信息学分析表明大部分差异蛋白与细胞骨架组成、急性期应答、抗氧化、应激应答、能量代谢,大分子物质代谢,信号转导和离子运输有关。用荧光定量PCR技术对热休克蛋白beta-1、膜联蛋白A2、波形蛋白、膜联蛋白A5、锰超氧化物歧化酶、线粒体磷酸烯醇丙酮酸羧基酶等14种差异表达蛋白进行转录水平的分析,其动态变化趋势与蛋白质组学的结果大部分是一致的。用western blot方法对三种差异表达蛋白膜联蛋白A2、膜联蛋白A5和热休克蛋白beta-1从表达水平上进行了验证,其结果与蛋白质组学得到的结果是一致的。实验结果表明,IBV强毒株ck/CH/LDL/97I P5和鸡胚传代致弱毒株ck/CH/LDL/97I P115感染能够诱导包括细胞骨架组成、抗氧化、应激应答、能量代谢等相关蛋白在内的一些在宿主应答过程中可能起重要作用的关键蛋白产生不同模式的表达变化,而且这种表达变化的差异主要发生在感染的早期阶段。本研究首次获得了较为完善的人工感染IBV自然宿主鸡的气管和肾脏组织的差异表达蛋白质数据,为进一步阐释IBV的致病机理,以及筛选到有价值的预防或治疗药物提供了有价值的信息。同时,本研究结果也为SARS-CoV等其他冠状病毒的相关研究提供了参考依据。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 图表清单
• 英文缩略表
• 第一章 引言
• 1.1 IBV 致病机制的研究进展
• 1.1.1 IBV 的一般分子生物学特性
• 1.1.2 IBV 的结构蛋白及功能
• 1.1.3 IBV 的感染与复制机制
• 1.1.4 IBV 的复制对宿主细胞的影响
• 1.2 蛋白质组学概述及其主要技术平台
• 1.2.1 蛋白质组学概述
• 1.2.2 蛋白质组学研究的主要技术平台
• 1.3 蛋白质组学在冠状病毒研究中的应用
• 1.3.1 冠状病毒颗粒的蛋白质组学分析
• 1.3.2 冠状病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用
• 1.3.3 冠状病毒感染的比较蛋白质组学分析
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 人工感染传染性支气管炎病毒鸡胚气管和肾脏的蛋白质组学分析
• 2.1 材料和方法
• 2.1.1 病毒和实验动物
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 主要仪器与软件
• 2.1.4 主要溶液配制
• 2.1.5 病毒感染实验
• 2.1.6 IBV 病毒RNA 的提取与基因组N 基因的检测
• 2.1.7 双向凝胶电泳分析
• 2.1.8 质谱分析
• 2.1.9 用荧光定量PCR 在转录水平上分析差异蛋白
• 2.1.10 用Western blot 分析差异蛋白的表达水平
• 2.2 结果
• 2.2.1 IBV 感染鸡胚的特征观察和病毒检测
• 2.2.2 鸡胚气管和肾脏组织双向凝胶电泳结果
• 2.2.3 差异表达蛋白分析结果
• 2.2.4 差异表达蛋白的质谱鉴定
• 2.2.5 差异表达蛋白的GO 注释分类
• 2.2.6 部分差异表达蛋白的转录水平分析
• 2.2.7 部分差异表达蛋白的Western blot 验证
• 2.3 讨论
• 2.4 小结
• 第三章 人工感染不同毒力传染性支气管炎病毒鸡气管和肾脏的蛋白质组学分析
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 病毒和实验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 主要仪器和软件
• 3.1.4 主要溶液配制
• 3.1.5 实验动物分组与病毒感染
• 3.1.6 样本采集
• 3.1.7 IBV 抗体效价的检测
• 3.1.8 气管组织样品的2-DE 分析
• 3.1.9 肾脏组织样品的2-DIGE 分析
• 3.1.10 质谱分析
• 3.1.11 差异蛋白质的GO 注释和相对表达量聚类分析
• 3.1.12 部分差异蛋白的 mRNA 水平动态变化分析
• 3.1.13 差异蛋白的Western blot 验证
• 3.2 结果
• 3.2.1 动物实验临床观察和血清IBV 抗体检测结果
• 3.2.2 不同毒力IBV 毒株感染鸡气管和肾脏组织的蛋白表达变化
• 3.2.3 差异表达蛋白的质谱鉴定
• 3.2.4 差异表达蛋白的GO 注释分类
• 3.2.5 差异表达蛋白的聚类分析
• 3.2.6 部分差异表达蛋白的mRNA 水平动态变化分析
• 3.2.7 部分差异表达蛋白的Western blot 验证
• 3.3 讨论
• 3.4 小结
• 第四章 结论
• 4.1 本论文主要结论
• 4.2 本论文创新点
• 4.3 尚待进一步解决的问题
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历