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人乳腺癌细胞Rab25基因的生物学行为及其与ER，PR，Her-2/neu的相关性研究

2020-11-29阅读(759)

人乳腺癌细胞Rab25基因的生物学行为及其与ER，PR，Her-2/neu的相关性研究

论文摘要

目的探讨性研究Rab25基因不同水平的表达对乳腺癌细胞的多种生物学活性的影响,对乳腺癌细胞株中ER及PR表达的影响。研究Rab25与Her-2/neu双基因转染入乳腺癌细胞后对癌细胞的生物活性所产生的影响。方法1.构建真核表达质粒pDNR-Dual-Rab25,通过质粒的转染和RNA干扰技术调控乳腺癌细胞株MCF-7,MDA-MB-231（MM231）,SK-BR-3中Rab25基因的表达水平,建立Rab25表达水平不同的一系列乳腺癌细胞株。2.构建真核表达质粒pDNR-Dual-Her-2/neu,通过质粒的转染和RNA干扰技术调节乳腺癌细胞株MCF-7,MM231,SK-BR-3中Her-2/neu的表达水平,建立Her-2/neu表达水平不同的一系列乳腺癌细胞株。3.流式细胞仪检测Rab25及Her-2/neu mRNA及SiRNA的转染率。4.荧光定量检测体系分析转染Rab25 mRNA及SiRNA后细胞内Rab25的表达水平。5.Western blot检测研究系列乳腺癌细胞株中ER,PR,Her-2/neu的蛋白表达。6.MTT法检测研究系列乳腺癌细胞增殖活性。7.细胞计数法检测研究系列乳腺癌细胞株克隆形成率。8.Matrigel胶（基质疑胶）侵袭力检测法检测研究系列乳腺癌细胞转移侵袭力。结果乳腺癌细胞株MCF-7中检测出Rab25基因的表达;MM231,SK-BR-3中未检测出Rab25基因的表达。在成功构建真核表达质粒pDNR-Dual-Rab25后转染入研究系列的乳腺癌细胞株,各株细胞新建质粒转染率较对照组均有明显统计学差异（P＜0.01）,提示成功转染Rab25 mRNA。经Rab25干扰后,检测各株细胞Rab25 SiRNA转染率较对照组均有明显统计学差异（P＜0.01）,提示成功转染Rab25 SiRNA。实时荧光定量PCR检测研究系列的细胞株中Rab25mRNA7d内相对表达量,结果显示各研究系列的细胞株转染Rab25 mRNA24h后的Rab25 mRNA表达量较0h明显增加,有明显统计学差异（P＜0.01）,提示转染Rab25 mRNA的细胞株中Rab25基因得到稳定表达。转染Rab25SiRNA组24h后的Rab25 mRNA表达量较0h明显减少,有明显统计学差异（P＜0.01）。提示转染Rab25 SiRNA的细胞株中Rab25基因的表达受到抑制。经检测,各研究系列的细胞株Rab25转染组增殖活性,克隆形成率,转移侵袭力均较Rab25干扰组,原株细胞组及对照组有明显增强,差别有统计学意义（P＜0.05）。转染Rab25 mRNA前,MCF-7细胞ER及PR的Western blot检测可得到清晰且分子量正确的条带。转染Rab25 mRNA后,各转染组细胞均可见清晰且分子量正确的ER及PR条带,且转染后MCF-7细胞的ER,PR条带较转染前明显加深。RNA干扰后,各干扰组细胞ER及PR条带较转染组明显变淡,且干扰后MCF-7细胞的ER,PR条带较转染后明显变淡,但与转染前无明显差异。成功构建真核表达质粒pDNR-Dual-Her-2/neu后转染入MCF-7细胞中,新建质粒转染率较对照组有明显统计学差异（P＜0.01）,提示转染Her-2/neu mRNA成功。经Her-2/neu干扰后,检测各株细胞Her-2/neu siRNA转染率较对照组均有明显统计学差异（P＜0.01）,提示转染Her-2/neu siRNA成功。Western blot检测各研究系列的细胞株中Her-2/neu的蛋白表达情况,结果显示MCF-7原株细胞中Her-2/neu低表达,MM231和SK-BR-3原株细胞中Her-2/neu高表达。Her-2/neu转染入MCF-7原株细胞后,其蛋白表达条带显影明显增强。提示Her-2/neu高表达的MCF-7细胞株的成功建立。经Her-2/neu干扰后,3株Her-2/neu高表达的细胞株中Her-2/neu蛋白表达条带显影明显减弱。提示Her-2/neu低表达的三株细胞成功建立。Her-2/neu低表达的乳腺癌细胞MCF-7在转染入Rab25基因后,其增殖活性,克隆形成率,转移侵袭力均明显增强,差别有统计学意义（P＜0.05）。Rab25高表达的乳腺癌细胞株MCF-7在转染入Her-2/neu基因后,细胞株的增殖,侵袭能力无明显改变,差别无统计学意义（P＞0.05）。Her-2/neu高表达的乳腺癌细胞株MM231及SK-BR-3在转染入Rab25基因后,其增殖活性,克隆形成率,转移侵袭力均明显增强,差别有统计学意义（P＜0.05）。Rab25及Her-2/neu双阳性高表达的乳腺癌细胞株MCF-7,MM231及SK-BR-3在Her-2/neu基因干扰后,其增殖活性,克隆形成率,转移侵袭力均没有明显改变,差别无统计学意义（P＞0.05）。结论研究发现各研究系列的乳腺癌细胞株的增殖活性,克隆形成率,转移侵袭力随着胞内Rab25基因表达水平的上调而增强,随着Rab25基因表达水平的下调而减弱,表明Rab25基因在乳腺癌细胞中发挥着促进癌细胞生长,增强其增殖及侵袭的作用,为拓展乳腺癌相关癌基因在该领域的基础研究及临床应用提供了新的研究因素和思路。ER,PR的蛋白表达水平随着各研究系列的乳腺癌细胞株中Rab25基因的转入及干扰相应出现上升和下降,提示乳腺癌细胞株中Rab25与ER、PR的表达水平具有一定同步性,提示Rab25的表达水平可能直接反映ER及PR的表达水平,对目前乳腺癌的诊疗提出新的思路和手段。Rab25单基因转染对乳腺癌细胞的增殖及侵袭能力起到促进作用,而Her-2/neu的表达水平不能影响Rab25高表达的乳腺癌细胞株增殖,侵袭能力,提示Rab25和Her-2/neu是通过不同的途径改变乳腺癌细胞的生物活性。为Rab25在乳腺癌中的基础研究提供了新的理论依据。

论文目录

  • 英文缩略语
  • 中文摘要
  • 英文摘要
  • 正文 人乳腺癌细胞Rab25基因的生物学行为及其与ER,PR,Her-2/neu的相关性研究
  • 前言
  • 第一章 Rab25对人乳腺癌细胞生物学活性的影响
  • 材料与方法
  • 结果
  • 1.Rab25 cDNA全长的扩增
  • 2.重组质粒pDNR-Dual-Rab25的构建及鉴定
  • 3.Rab25 mRNA转染效率检测
  • 4.Rab25siRNA转染效率检测
  • 5.实时荧光定量RT-PCR检测Rab25mRNA在乳腺癌细胞株中的表达
  • 6.细胞增殖活力检测
  • 7.细胞克隆计数检测
  • 8.细胞侵袭力检测
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 第二章 乳腺癌细胞中Rab25基因与ER、PR的相关性研究
  • 材料与方法
  • 结果
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 第三章 Rab25与Her-2/neu双基因转染对乳腺癌细胞生物学活性影响的研究
  • 材料与方法
  • 结果
  • 1.Her-2/neu cDNA全长的扩增
  • 2.重组质粒pDNR-Dual-Her-2/neu的构建及鉴定
  • 3.Her-2/neu mRNA转染至高表达Rab25的MCF-7细胞的效率检测
  • 4.Her-2/neu siRNA转染效率测定
  • 5.研究系列的乳腺癌细胞中Her-2/neu蛋白检测
  • 6 细胞增殖活力检测
  • 7.细胞克隆计数检测
  • 8.细胞侵袭力检测
  • 讨论
  • 结论
  • 参考文献
  • 全文总结
  • 附图表
  • 文献综述 Rab25与ER,PR,Her-2/neu在乳腺癌中的研究
  • 参考文献
  • 致谢

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