以PDF为靶点的新药筛选及活性组分的分离纯化、结构鉴定与活性研究

论文摘要

随着抗生素的广泛使用甚至滥用,各种耐药病原菌大量出现,目前临床耐药菌的发展势态已对人类健康构成极大的威胁。寻找新的作用靶点,研发新型抗耐药菌的药物已成为本世纪全球关注的研究热点之一。肽脱甲酰基酶（peptide deformylase,PDF）是原核生物蛋白成熟过程中的一个关键酶,而非真核生物所必需。鉴于PDF具有作为药物筛选靶点的众多优点,近年来被广泛认同为最理想的新一代广谱抗菌药物筛选分子靶点之一。本研究采用分子生物学的方法与技术对屎肠球菌（E.faecium）的PDF酶进行克隆表达,用Ni2+金属螯合亲和层析柱对目的蛋白进行分离纯化,对纯化所得PDF进行Western blotting鉴定与活性检测。以纯化的PDF为靶点开展了抑酶活性物质筛选和以E.faecium为检定菌的抑菌活性物质筛选。通过对20261个微生物发酵样品的初筛和对初筛阳性样品的两次复筛,获得6株发酵产物活性稳定的阳性菌株,其中游动放线菌103A-00723和游动放线菌103A-08772的发酵产物对多种G+耐药细菌有抑菌活性,包括MRSA、MRSE、E.faecalis HH22（含双功能修饰酶的粪肠球菌）和VRE。经分类鉴定,这两株菌为游动放线菌属的两个新种,分别被命名为Actinoplanes sichuanensis sp.nov.和Actinoplanes Xinjiangensis sp.nov.。链霉菌I06A-01113的发酵产物抗VRE和S.aureus（金黄色葡萄球菌）的敏感株,但不抗MRSA。对获得的阳性菌株I03A-00723进行放大发酵,并对发酵产物进行分离纯化,得到95-1、95-1-h1、95-2、95-3、135、205-1、205-2和205-3八个单一组分,经结构分析95-1、95-2、135、205-1分别被确定为Nb-乙酰色胺、大豆苷元、染料木素和腺苷,95-1-h1、95-3、205-2和205-3因量太少,其结构有待进一步鉴定。本研究首次从游动放线菌中分离得到Nb-乙酰色胺、大豆苷元和染料木素,并首次发现这三个活性物质对PDF酶有抑制作用,而且对E.faecium有抗菌活性,且大豆苷元和染料木素对VRE的抗菌活性优于阳性对照Actinonin。含量极少的组分95-3对VRE的抗菌活性优于Actinonin和已报道的阳性化合物BB3497和VRC3375,与已进入临床研究的阳性化合物LBM415的抗菌活性相当,是值得深入研究的组分。本研究还以PDF的晶体结构为基础,采用sybyl7.3软件中的Surflex-Dock对我室Microbial Natural Products Database（微生物天然产物库）进行了虚拟筛选,对部分虚拟筛选阳性化合物进行了抑酶和抗菌活性检测。结果发现,虚拟筛选获得的阳性化合物Polyoxin B、Spergualin和L-4-oxalysine具有一定的抑酶和抗菌活性。同时,对实物筛选获得的阳性化合物和已知阳性抑制剂（Actinonin、LBM415、BB83698、VRC4307、VRC3375和BB3497）与PDF进行分子了对接,发现阳性化合物95-2、135和已知阳性抑制剂的虚拟筛选得分和它们的抑酶和抗菌活性相一致。本研究采用实物筛选与虚拟筛选相结合的方法,得到若干活性化合物,为寻找以PDF为靶点的新药或其先导化合物奠定了基础。

论文目录

• 缩略语一览表
• 中文摘要
• Abstract
• 前言
• 1 实验材料
• 1.1 主要菌株
• 1.2 质粒
• 1.3 主要培养基
• 1.3.1 大肠杆菌培养基
• 1.3.2 E.faecium培养基
• 1.3.3 斜面培养基
• 1.3.4 发酵培养基
• 1.4 引物
• 1.5 工具酶
• 1.6 试剂盒
• 1.7 分离介质
• 1.8 主要试剂
• 1.9 主要溶液
• 1.9.1 E.faecium总DNA提取缓冲液
• 1.9.2 琼脂糖凝胶电泳缓冲液
• 1.9.3 大肠杆菌DH5α/大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞制备液
• 1.9.4 SDS-PAGE电泳有关缓冲液
• 1.9.5 蛋白纯化缓冲液
• 1.9.6 Western blotting试剂与缓冲液
• 1.9.7 酶活性检测缓冲液
• 1.9.8 Actinonin贮存液
• 1.10 其它材料
• 1.11 主要仪器
• 2 实验方法
• 2.1 PDF的表达
• 2.1.1 E.faecium总DNA的提取分离
• 2.1.2 PCR扩增目的DNA片段
• 2.1.3 DNA琼脂糖凝胶电泳
• 2.1.4 回收目的DNA片断
• 2.1.5 PCR产物末端加A反应
• 2.1.6 末端加A的PCR产物与pGEM-T Easy Vector的连接
• 2法制备DH5α感受态细胞（BL21（DE3）感受态细胞同样制备）'>2.1.7 CaCl₂法制备DH5α感受态细胞（BL21（DE3）感受态细胞同样制备）
• 2.1.8 DNA连接产物转化DH5α感受态细胞
• 2.1.9 PCR法初步鉴定目的基因是否连接到表达载体中
• 2.1.10 质粒DNA的小量提取
• 2.1.11 质粒双酶切鉴定
• 2.1.12 蛋白表达载体的构建
• 2.1.13 目的蛋白的诱导表达
• 2.1.14 SDS-PAGE电泳检测
• 2.2 PDF的纯化和分析
• 2.2.1 金属鏊合层析纯化原理
• 2.2.2 样品的预处理
• 2.2.3 使用AKTA prime系统纯化蛋白
• 2.2.4 SDS-PAGE电泳检测
• 2.2.5 超滤
• 2.2.6 蛋白浓度检测
• 2.2.7 酶的贮存
• 2.2.8 Western blotting分析
• 2.3 PDF的活性分析
• 2.3.1 酶活性分析原理
• 2.3.2 酶活性的初步检测
• 2.3.3 阳性对照Actinonin对酶的作用
• 2.4 筛选模型的恢复
• 2.4.1 确定最佳底物浓度
• 2.4.2 反应步骤
• 2.4.3 酶抑制率计算
• 2.5 药物筛选
• 2.5.1 发酵液样品的筛选
• 2.5.2 化合物的虚拟筛选
• 2.6 I03A-00723菌株的小量发酵和初提
• 2.6.1 斜面培养基的确定
• 2.6.2 发酵时间及活性部位的确定
• 2.6.3 热稳定性检测
• 2.6.4 提取条件（pH值）的确定
• 2.7 I03A-00723菌株的大量发酵和分离纯化
• 2.8 化合物的鉴定和结构解析
• 2.8.1 化合物的性状观察
• 2.8.2 化合物的纯度分析
• 2.8.3 化合物的紫外吸收光谱
• 2.8.4 化合物的质谱分析
• 2.8.5 化合物的核磁共振谱分析
• 2.9 化合物的活性测定
• 2.9.1 化合物的抑酶活性测定
• 2.9.2 化合物的抗菌活性测定
• 2.10 分离纯化的活性化合物与PDF的分子对接
• 3 结果与分析
• 3.1 PDF的表达
• 3.1.1 E.faecium总DAN的提取分离
• 3.1.2 PCR扩增结果
• 3.1.3 PCR初步检测
• 3.1.4 双酶切检测
• 3.1.5 序列测定
• 3.2 PDF的纯化和鉴定
• 3.2.1 AKTA prime系统纯化目的蛋白
• 3.2.2 SDS-PAGE检测诱导及分离纯化的目的蛋白
• 3.2.3 Western blotting分析
• 3.3 PDF的活性分析
• 3.3.1 酶活性的初步检测
• 3.3.2 阳性对照Actinonin的抑酶活性
• 3.4 最佳底物浓度分析
• 3.5 药物筛选
• 3.5.1 发酵液样品的筛选
• 3.5.2 化合物的虚拟筛选
• 3.6 I03A-00723菌株的小量发酵和初提
• 3.6.1 斜面培养基的确定
• 3.6.2 发酵时间及活性部位的确定
• 3.6.3 热稳定性检测
• 3.6.4 提取条件（pH值）的确定
• 3.7 I03A-00723菌株的大量发酵和分离纯化
• 3.8 化合物的理化性质分析和结构鉴定
• 3.8.1 化合物95-1的理化性质分析和结构鉴定
• 3.8.2 化合物95-1-h1的理化性质分析和结构鉴定
• 3.8.3 化合物95-2的理化性质分析和结构鉴定
• 3.8.4 化合物95-3的理化性质分析和纯度分析
• 3.8.5 化合物135的理化性质分析和结构鉴定
• 3.8.6 化合物205-1的理化性质分析和结构鉴定
• 3.8.7 化合物205-2的理化性质分析和结构鉴定
• 3.8.8 化合物205-3的理化性质分析和结构鉴定
• 3.9 化合物的活性检测
• 3.9.1 化合物的抑酶活性检测
• 3.9.2 化合物的抗菌活性检测
• 3.10 分离纯化的活性化合物与PDF的分子对接
• 4 讨论
• 5 结论
• 参考文献
• 文献综述
• 附录
• 致谢