两种典型手性农药内分泌干扰效应的对映体选择性研究

论文摘要

农业生产、家居生活中手性农药的广泛使用,使其不可避免地进入到环境系统、野生动植物以及人体中。手性农药的各对映体在生物过程中存在着较大的差异性,故表现出不同的生态毒性。手性农药的使用与环境安全已成为一个全球关注的新问题。目前环境领域关于手性农药的研究,大多集中于环境命运、急性水生毒性等方面的对映体选择性,但在内分泌干扰方面的研究,少之又少。因此,我们选取两种比较典型的手性农药——持久性有机污染物的重要成员o,p′-DDT及一种目前广泛使用的拟除虫菊酯杀虫剂联苯菊酯（bifenthrin）为对象,在不同的体内和体外模型中研究了它们类雌激素效应的对映体选择性差异。在此基础上,进一步对o,p′-DDT内分泌干扰效应的对映体选择性差异所造成的对人乳腺肿瘤和人类胎盘发生过程的影响的对映体选择性进行了研究,以探讨手性化合物的内分泌干扰效应可能导致的对人类健康影响的对映体选择性差异及其机理。在将这两种手性农药成功拆分得到对映体纯样品的基础上,我们主要研究了以下四部分内容:（1）选用雌激素依赖型的人乳腺癌MCF-7细胞系为研究模型,采用MCF-7细胞增殖实验（即E-SCREEN实验）、实时荧光定量PCR（qRT-PCR）等方法,评价了o,p′-DDT雌激素效应的对映体选择性。研究结果显示:R-（-）-o,p′-DDT较S-（+）-o,p′-DDT能够更显著地刺激MCF-7细胞的增殖,同时,R-（-）-o,p′-DDT在诱导雌激素依赖型的报告基因pS2的表达上调与抑制雌激素受体α及β（ERα、ERβ）基因表达等方面的效应均高于S-（+）-o,p′-DDT。我们的研究结果表明,o,p′-DDT的类雌激素效应具有明显的对映体选择性,R-（-）-o,p′-DDT的雌激素活性远高于S-（+）-o,p′-DDT,而且o,p′-DDT的类雌激素效应与经典的雌激素受体（ER）介导的信号通路有关。（2）已有研究表明环境雌激素类化合物与乳腺癌的发生、发展有一定的正相关性,而o,p′-DDT是一种典型的环境雌激素物质。在评价了o,p′-DDT类雌激素效应的对映体选择性的基础上,我们首次对o,p′-DDT对乳腺肿瘤影响的对映体选择性进行了研究。在人乳腺癌MCF-7细胞系体外模型中,通过细胞间黏附分析实验、qRT-PCR检测与乳腺肿瘤侵润、黏附、增殖相关的MMP-9、MMP-2、TIMP-1、TIMP-2、E-cadherin、β-catenin、hTERT等分子的mRNA表达情况,来初步探索o,p′-DDT影响乳腺肿瘤发展的对映体选择性及其机理。研究结果显示:o,p′-DDT能促进乳腺癌细胞MCF-7的侵润能力,而这种作用与MMP-9、MMP-2分子表达的上调和细胞间黏附性降低有关。同时R-（-）-o,p′-DDT对细胞侵润的促进效应高于S-（+）-o,p′-DDT。此外,细胞增殖的加快是肿瘤发展的一个明显特征,我们的结果显示o,p′-DDT的外消旋体及其对映体皆能够上调端粒酶催化亚基hTERT基因的表达,且R-（-）-o,p′-DDT的诱导效应显著高于S-（+）-o,p′-DDT,这是o,p′-DDT对映体对乳腺癌细胞增殖影响的可能机理之一。结合我们前面的研究结果,我们认为o,p′-DDT雌激素效应的对映体选择性差异,可能是造成o,p′-DDT对乳腺癌影响具有选择性的一个主要原因。（3）人类胎盘发生过程是正常妊娠的重要生理保障。而胎盘的发生是一个受多种激素及其它因素精细调节的过程。目前关于环境雌激素是否能够干扰这一过程的研究非常有限。我们以人绒毛膜癌JEG-3细胞系为研究模型,通过酶联免疫实验（ELISA）测定孕酮分泌量及qRT-PCR检测与人胎盘发生过程相关的PR、HILA-G、GnRH-Ⅰ及GnRHR-Ⅰ等分子的mRNA表达情况,来探讨手性环境污染物（以o,p′-DDT为例）对人类生殖健康影响的对映体选择性及机理。结果显示:o,p′-DDT可以诱导绒毛膜癌细胞系JEG-3的孕酮激素分泌以及孕酮受体表达、上调妊娠免疫分子HILA-G的表达,同时促进多肽类激素GnRH-Ⅰ等的表达。以上效应均表现出一致的对映体选择性,即R-（-）-o,p′-DDT对滋养层细胞内分泌干扰的效应高于S-（+）-o,p′-DDT。以上（1）、（2）、（3）关于o,p′-DDT的研究结果表明,o,p′-DDT的类雌激素效应具有明显的对映体选择性,而且这种选择性在不同组织（人类乳腺、人类胎盘）中显示出一致性,即R-（-）-o,p′-DDT的内分泌干扰效应总是高于S-（+）-o,p′-DDT。因此,在研究手性化合物雌激素效应的对映体选择性的同时,更要关注由此带来的健康风险评价中的一系列与人类健康相关的问题。（4）迄今为止,关于内分泌干扰效应方面的对映体选择性的研究基本局限于o,p′-DDT及其类似物。已有的研究结果显示,目前广泛使用的拟除虫菊酯类杀虫剂,具有潜在的内分泌干扰效应,但在对映体水平上尚未见任何相关报道。因此,我们选用当前广泛使用的拟除虫菊酯杀虫剂联苯菊酯（bifenthrin,BF）为对象,来研究手性农药在拟雌激素效应及体内吸收方面的对映体差异性。以MCF-7细胞系作为体外实验的模型,以及水生脊椎动物日本青鳉鱼（Japanesemedaka,Oryzias latipes）作为体内实验模型的研究结果显示,1S-cis-BF较1R-cis-BF具有更强的雌激素活性。1S-cis-BF刺激MCF-7细胞增殖是1R-cis-BF的3.6倍,同时1S-cis-BF诱导雄性日本青鳉鱼肝脏内卵黄蛋白原（vitellogenin,VTG）的分泌效应为1R-cis-BF的123倍。此外,在日本青鳉鱼的肝脏及剔除肝脏的整个鱼体中,皆可以观察到显著的对映体选择性吸收,1R-cis-BF的吸收量分别为1S-cis-BF的5倍（肝脏）、3倍（剔除肝脏的整个鱼体）左右。我国作为农药生产和使用的大国,手性农药的使用量占40%以上,而且这一比例还在不断增长。同时,农药作为环境内分泌干扰物已引起广泛的关注。我们的研究结果再次说明,评价手性农药的环境安全性时,在考虑其急性毒性的同时、更要充分考虑其慢性生态毒性（如内分泌干扰）的对映体选择性,及由此造成的对人类健康负面影响的对映体选择性差异。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 绪论
• 1.1 前言
• 1.2 环境中的内分泌干扰物
• 1.2.1 环境内分泌干扰物的定义
• 1.2.2 环境内分泌干扰物的来源与分类
• 1.2.3 环境内分泌干扰物的危害
• 1.2.4 环境内分泌干扰物的作用机制
• 1.2.5 环境内分泌干扰物的检测技术
• 1.2.5.1 物理检测技术
• 1.2.5.2 生物检测技术
• 1.3 日本青鳉鱼在内分泌干扰研究中的应用
• 1.3.1 鱼类应用于内分泌干扰研究的主要测试终点和敏感效应指标
• 1.3.2 日本青鳉鱼的主要生物学特性及其在内分泌干扰研究中的应用
• 1.4 农药的内分泌干扰研究现状
• 1.4.1 除草剂所引起的内分泌干扰现象
• 1.4.2 杀虫剂所引起的内分泌干扰现象
• 1.4.3 杀菌剂所引起的内分泌干扰现象
• 1.5 手性及对映异构体
• 1.5.1 手性的相关概念
• 1.5.2 对映异构体的性质
• 1.5.3 境分析中对映异构体混合物的定量方法
• 1.5.3.1 对映体比率（er和ER）
• 1.5.3.2 对映体过剩（ee）
• 1.5.3.3 对映体分数（EF）
• 1.5.3.4 三者之间关系
• 1.6 手性农药的内分泌干扰研究现状
• 1.7 本课题的提出及研究内容
• 第1章参考文献
• 第2章 o,p'-DDT的雌激素效应的对映体选择性
• 2.1 前言
• 2.1.1 手性持久性有机污染物
• 2.1.2 典型手性持久性有机污染物o,p'-DDT
• 2.1.3 本实验的成因及创新所在
• 2.2 实验部分
• 2.2.1 o,p'-DDT对映体的制备及判定
• 2.2.1.1 主要仪器及试剂
• 2.2.1.2 拆分及判定条件
• 2.2.1.3 其它补充说明
• 2.2.2 细胞系、细胞培养
• 2.2.2.1 细胞系
• 2.2.2.2 主要仪器
• 2.2.2.3 主要试剂
• 2.2.2.4 主要用液
• 2.2.2.5 细胞的培养
• 2.2.2.6 细胞的传代
• 2.2.2.7 细胞的冻存
• 2.2.2.8 细胞的复苏
• 2.2.2.9 细胞计数
• 2.2.3 细胞增殖实验
• 2.2.3.1 主要仪器及试剂
• 2.2.3.2 主要用液
• 2.2.3.3 实验方法
• 2.2.3.4 统计分析
• 2.2.3.5 评价内分泌干扰物的雌激素效应的指标
• 2.2.4 RNA的提取及反转录
• 2.2.4.1 主要仪器及试剂
• 2.2.4.2 细胞的处理
• 2.2.4.3 细胞总RNA的提取
• 2.2.4.4 反转录（reverse transcription）
• 2.2.5 荧光定量PCR
• 2.2.5.1 主要仪器及试剂
• 2.2.5.2 实验方法
• 2.2.5.3 统计分析
• 2.3 结果与讨论
• 2.3.1 对映体的制备及判定
• 2.3.2 在E-SCREEN实验中的对映体选择性
• 2.3.3 在MCF-7细胞中诱导pS2 mRNA表达的对映体选择性
• 2.3.4 在MCF-7细胞中抑制ERα、ERβmRNA表达的对映体选择性
• 2.4 本章小结
• 第2章参考文献
• 第3章 o,p'-DDT对乳腺肿瘤影响的对映体选择性
• 3.1 前言
• 3.2 实验部分
• 3.2.1 人乳腺癌细胞系MCF-7的培养
• 3.2.2 荧光定量RT-PCR
• 3.2.3 细胞间黏附分析实验
• 3.3 结果与讨论
• 3.3.1 o,p'-DDT对MCF-7细胞中侵润相关分子表达影响的对映体选择性
• 3.3.2 o,p'-DDT对MCF-7细胞-细胞黏附及其相关分子表达影响的对映体选择性
• 3.3.3 o,p'-DDT对MCF-7细胞中端粒酶催化亚基hTERT表达影响的对映体选择性
• 3.4 本章小结
• 第3章参考文献
• 第4章 o,p'-DDT对人胎盘发生过程影响的对映体选择性
• 4.1 前言
• 4.2 实验部分
• 4.2.1 人绒毛膜癌细胞系JEG-3的培养
• 4.2.2 荧光定量RT-PCR
• 4.2.3 用ELISA试剂盒测定孕酮P4含量
• 4.3 结果与讨论
• 4.3.1 o,p'-DDT对JEG-3细胞P4分泌和孕酮受体（PR）表达影响的对映体选择性
• 4.3.2 o,p'-DDT对JEG-3细胞中HILA-G表达的对映体选择性
• 4.3.3 o,p'-DDT对JEG-3细胞中GnRH-I和GnRHR-I表达的对映体选择性
• 4.4 本章小结
• 第4章参考文献
• 第5章 联苯菊酯在雌激素效应及吸收方面的对映体选择性
• 5.1 前言
• 5.2 实验部分
• 5.2.1 联苯菊酯对映体的制备
• 5.2.2 MCF-7细胞增殖实验
• 5.2.3 日本青鳉鱼肝脏内卵黄蛋白原水平的检测
• 5.2.4 联苯菊酯对映体在日本青鳉鱼体内的选择性吸收
• 5.3 结果与讨论
• 5.3.1 联苯菊酯对映体的拆分及制备
• 5.3.2 联苯菊酯在体外E-SCREEN实验中的对映体选择性
• 5.3.3 联苯菊酯在日本青鳉鱼体内卵黄蛋白原酶联免疫实验中的对映体选择性
• 5.3.4 联苯菊酯在日本青鳉鱼体内吸收中的对映体选择性
• 5.4 本章小结
• 第5章参考文献
• 第6章 研究结果及未来工作展望
• 6.1 研究结果
• 6.1.1 两种手性农药o,p'-DDT和联苯菊酯对映体的拆分及判定
• 6.1.2 o,p'-DDT的慢性毒性效应的对映体选择性
• 6.1.2.1 o,p'-DDT类雌激素效应的对映体选择性
• 6.1.2.2 o,p'-DDT对乳腺肿瘤影响的对映体选择性
• 6.1.2.3 o,p'-DDT对人类胎盘发生过程影响的对映体选择性
• 6.1.3 联苯菊酯在类雌激素效应及吸收方面的对映体选择性
• 6.2 未来工作展望
• 6.2.1 手性农药的内分泌干扰研究领域亟需加强
• 6.2.2 不局限于雌激素效应,还应关注内分泌干扰的其它方面
• 6.2.3 对实验现象进行总结,寻求普遍规律
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表或录用的论文