东方拟无枝酸菌HCCB10007 vcm4基因阻断及其阻断突变株代谢产物研究

论文摘要

万古霉素是目前临床上用于治疗由耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MASA）引起的严重感染疾病的首选药物。但20世纪80年代报道发现对万古霉素耐药的肠球菌以来,其耐药菌的出现呈增长趋势,基于这种状况,开发治疗耐药菌感染的新型糖肽类抗生素势在必行。利用基因工程技术对其生物合成途径进行改造,或是利用其中的功能基因体外表达催化合成新的杂合糖肽类抗生素,是目前研究的一个热点。本论文运用PCR-targeting的方法对东方拟无枝酸菌万古霉素非核糖体多肽合成酶基因进行改造并对获得的突变株发酵产物进行研究,内容包括:阻断万古霉素非核糖体多肽合成酶基因vcm4。通过PCR-targeting的方法对万古霉素产生菌Amycolatopsis orientalis HCCB10007中vcm4基因进行阻断,将安普霉素抗性基因盒替换vcm4基因内部500 bp片段,使其不能正常表达万古霉素非核糖体多肽合成酶Vcp3,进而阻断万古霉素的生物合成。通过对突变株染色体PCR验证和目的序列测序检验以及突变菌株发酵,证实安普霉素抗性基因盒替换预期序列。对阻断突变株A.orientalis dA9的发酵产物进行的检测表明,该菌株不合成糖肽类抗生素,但首次发现其能产生非万古霉素类的抗菌活性物质。对A.orientalis dA9产生的抗菌活性物质进行了研究,通过浸提、反相TLC、HPLC等检测发现抗菌活性源自HPLC出峰时间接近的两个物质LYV2007lw1和LYV2007lw2。通过中压层析进行了产物纯化,经质谱和核磁测定确证了结构,证实LYV2007lw1为文献报道的产物ECO-0501,LYV2007lw2为其去甲基衍生物。与出发株相比,突变菌株产生LYV2007lw1和LYV2007lw2的量比出发菌株提高了8倍和35倍。对阻断突变株A.orientalis dA9的培养条件包括接种时间、发酵培养基、最适初始pH、最适培养温度、接种量、溶氧等进行了考察,获得了优化的发酵条件;优化条件下,A.orientalis dA9产生LYV2007lw1及LYV2007lw2总量比文献报道的条件分别提高了33%和31%。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 缩略语（中英文全称）
• 第一篇 文献综述
• 1.前言
• 2.万古霉素研究概述
• 2.1.万古霉素发展概况
• 2.2.万古霉素的作用机理
• 2.3.万古霉素的耐药基因
• 2.4.万古霉素的生物合成机理
• 3.新型糖肽类抗生素的研究与开发
• 3.1.糖肽类抗生素的结构与分类
• 3.2.糖肽类抗生素的半合成改造
• 3.3.半合成的糖肽类抗生素
• 3.4.组合生物合成的应用
• 4.PCR-targeting重组系统简介
• 4.1.基因突变体构建的常用方法
• 4.2.PCR-targeting系统进行重组的原理
• 5.立题依据
• 第二篇 试验部分
• 第一章 vcm4的阻断及非糖肽类抗菌物质的发现
• 1.前言
• 2.材料
• 2.1.菌种及质粒
• 2.2.培养基及生化试剂
• 2.3.主要溶液
• 2.4.抗生素及其使用浓度
• 2.5.主要仪器和设备
• 3.方法
• 3.1.东方拟无枝酸菌HCCB10007的培养
• 3.2.碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA
• 3.3.大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 3.4.DNA片段凝胶回收（V-gene DNA Gel Extraction Kit）
• 3.5.PCR扩增安普霉素抗性基因盒
• 3.6.大肠杆菌电转感受态的制备及电转化
• 3.7.质粒从大肠杆菌向东方拟无枝酸菌的接合转移
• 3.8.东方拟无枝酸菌染色体的提取
• 3.9.东方拟无枝酸菌vcm4阻断突变株的验证
• 3.10.生物活性测定
• 4.结果与分析
• 4.1.由λRED重组酶介导的基因阻断方法PCR-targeting
• 4.2.东方拟无枝酸菌vcm4阻断突变株的验证
• 4.3.非糖肽类生物活性物质的发现
• 4.4.东方拟无枝酸菌vcm4阻断突变株的稳定性考察
• 5.讨论
• 6.结论
• 第二章 新发现物质的分离及结构确证
• 1.前言
• 2.材料
• 2.1.菌种
• 2.2.药品及试剂
• 2.3.仪器设备
• 2.4.培养基
• 3.方法
• 3.1.发酵流程
• 3.2.浸提试剂的筛选
• 3.3.活性物质反相TLC检测方法的确立
• 3.4.活性物质的中压层析制备
• 3.5.高效液相色谱制备纯化活性物质
• 3.6.活性物质的结构确定
• 4.结果与分析
• 4.1.最佳浸提试剂的确定
• 4.2.活性物质反相TLC条件的确定
• 4.3.中压层析法分离活性物质
• 4.4.高效液相色谱制备活性物质
• 4.5.活性物质的结构确定
• 5.讨论
• 6.结论
• 第三章 LYV20071w1和LYV20071w2发酵工艺的优化
• 1.前言
• 2.材料
• 2.1.菌种
• 2.2.药品及试剂
• 2.3.仪器设备
• 2.4.培养基
• 3.方法
• 3.1.发酵流程
• 3.2.发酵液的预处理
• 3.3.种子最佳种龄的确定
• 3.4.HPLC检测
• 3.5.单因素分析
• 3.6.发酵条件的优化
• 4.结果与分析
• 4.1.不同培养基的选择
• 4.2.种龄的确定
• 4.3.单因素分析
• 4.4.发酵条件的优化
• 5.讨论
• 6.结论
• 全文总结
• 参考文献
• 附录
• 致谢