细粒棘球蚴EG95-（C3d）3重组蛋白生物学特性的初步研究

论文摘要

细粒棘球蚴病（Echinococcosis granulosis）,是由细粒棘球绦虫处于续绦期的幼虫所引起的一种严重危害人畜健康的寄生虫病,是中国卫生部规划防治的五大寄生虫病之一。由于使用药物和包囊摘除的方法治疗包虫病的效果并不理想,因此对于该病来说目前主要以预防为主。基因工程疫苗以其高效性及特异性的特点成为预防该病最理想的方法。近年来,研究发现细粒棘球蚴EG95表达产物作为免疫抗原免疫动物产生的抗感染能力明显高于其他几种免疫抗原,并且该免疫抗原使动物体内产生特异性抗体能力的时间达1年以上；同时研究还发现这种产生抗细粒棘球蚴抗体的能力可以通过母羊遗传给下一代小羊。另外,有研究表明免疫佐剂可以增强EG95抗原对机体的保护作用。补体C3d分子作为一种新型的分子佐剂,由于该分子具有较强的增加机体对外源蛋白免疫能力,从而越来越受到学者的关注。有研究数据显示,串联的三个拷贝C3d对机体的免疫增强作用更强。然而在疫苗生产和研制的过程中,作为免疫抗原的蛋白常常由于表达量低、蛋白不可溶等缺陷制约了该种抗原在实际上的应用。基于以上背景,本研究利用杆状病毒表达系统表达EG95-（C3d）3重组蛋白,同时制备了细粒棘球蚴EG95基因的单克隆抗体。利用单克隆抗体的抗原识别特异性,对EG95-（C3d）3原核表达重组蛋白及利用杆状病毒表达系统表达的重组蛋白进行抗原识别位点的比较。将EG95基因串联到含有三个拷贝C3d的原核表达载体中,从而获得EG95-（C3d）3串联基因。利用pFastBac-HTa转移载体将EG95-（C3d）3克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中,在sf9昆虫细胞中表达EG95-（C3d）3重组融合蛋白。Western-blot检测结果显示：表达的EG95-（C3d）3重组融合蛋白能与细粒棘球蚴阳性血清产生特异性反应,表明其具有良好的免疫原性。利用体外融合技术,将免疫小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,经过4次亚克隆筛选得到12株单克隆抗体。亚类鉴定结果表明所有单抗,均属于IgGⅠ型抗体；Western-blot检测结果显示获得的12株MAbs对细粒棘球蚴EG95基因原核表达重组蛋白均具有特异性。通过对EG95-（C3d）3原核表达蛋白及杆状病毒表达蛋白的结构和抗原识别位点的比较,结果发现由于昆虫细胞-杆状病毒表达系统对表达的蛋白具有翻译后加工修饰的作用,其空间结构与原核表达蛋白具有一定的差异,MAbs只识别昆虫细胞-杆状病毒表达系统表达的蛋白的构象表位,当该重组蛋白呈线性表位时与MAbs不作用。本研究实现了EG95-（C3d）3基因的真核表达,获得了一种新型的细粒棘球蚴抗原,通过与原核表达蛋白的比较,结果显示该抗原在构象及抗原识别位点都存在着差异,为比较由不同表达系统制备抗原在机体保护力上是否存在差异奠定了基础,同时推动细粒棘球蚴疾病诊断和分子疫苗的研制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 细粒棘球蚴病的研究进展
• 1.1 前言
• 1.1.2 细粒棘球蚴的病原学分析
• 1.1.3 细粒棘球蚴病的预防和控制
• 1.1.4 EG95重组抗原的研究进展
• 1.2 C3d分子免疫佐剂的研究
• 1.2.1 前言
• 1.2.2 C3d的作用原理
• 1.2.3 C3d的研究进展
• 1.3 研究的目的及意义
• 第二章 羊C3d基因与细粒棘球蚴EG95s基因在杆状病毒中的串联表达
• 2.1 前言
• 2.2 实验材料
• 2.2.1 菌株和载体
• 2.2.2 细胞及培养用试剂
• 2.2.3 分子生物学试剂
• 2.2.4 免疫学试剂
• 2.2.5 主要化学试剂
• 2.2.6 溶液及其配制方法
• 2.3 方法
• 3原核表达质粒的构建'>2.3.1 EG95-（C3d）₃原核表达质粒的构建
• 2.3.2 重组转移载体的构建及鉴定
• 2.3.3 重组转移载体的转座及重组转座子的提取与鉴定
• 2.3.4 转染
• 2.3.5 重组杆状病毒的表达及鉴定
• 2.4 实验结果
• 2.4.1 原核表达质粒的构建
• 2.4.2 重组转移载体的构建及鉴定
• 2.4.3 重组杆状病毒的表达及鉴定
• 2.5 讨论
• 第三章 细粒棘球蚴EG95s基因的单克隆抗体制备及鉴定
• 3.1 前言
• 3.2 材料
• 3.2.1 菌株、细胞及实验动物
• 3.2.2 纯化重组蛋白的相关试剂
• 3.2.3 细胞培养用溶液及其配制
• 3.2.4 MAbs制备相关试剂及其配制
• 3.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）使用试剂及其配制
• 3.2.6 主要仪器设备
• 3.3 方法
• 3.3.1 重组EG95蛋白的表达与纯化
• 3.3.2 动物免疫
• 3.3.3 间接ELISA筛选方法的建立
• 3.3.4 杂交瘤细胞株的建立
• 3.3.5 单克隆抗体的大量制备
• 3.3.6 杂交瘤细胞的冻存及复苏
• 3.3.7 单克隆抗体的鉴定
• 3.4 结果
• 3.4.1 重组Eg95s蛋白的表达与纯化
• 3.4.2 阴阳性临界值（即cutoff值）的确定
• 3.4.3 细胞融合与筛选
• 3.4.4 杂交瘤细胞培养上清液及腹水效价的测定
• 3.4.5 MAbs的亚类鉴定
• 3.4.6 Western-blot检测
• 3.4.7 相加指数法测定单抗识别表位
• 3.5 讨论
• 第四章 细粒棘球蚴基因的原核与真核表达产物的比较
• 4.1 前言
• 4.2 实验材料
• 4.2.1 菌株及细胞
• 4.2.2 主要试剂
• 4.3 方法
• 3原核表达重组蛋白表达'>4.3.1 pET-EG95-（C3d）₃原核表达重组蛋白表达
• 3进行Western-blot检测'>4.3.2 EG95 MAbs对pET-EG95-（C3d）₃进行Western-blot检测
• 3重组蛋白进行免疫荧光检测'>4.3.3 EG95 MAbs对杆状病毒表达的EG95-（C3d）₃重组蛋白进行免疫荧光检测
• 4.4 实验结果
• 3重组蛋白表达'>4.4.1 pET-EG95-（C3d）₃重组蛋白表达
• 3重组蛋白Western-blot检测'>4.4.2 EG95单克隆抗体对pET-EG95-（C3d）₃重组蛋白Western-blot检测
• 3重组蛋白间接免疫荧光检测'>4.4.3 EG95单克隆抗体对Bacmid-EG95-（C3d）₃重组蛋白间接免疫荧光检测
• 4.5 讨论
• 第五章 全文结论
• 3基因在杆状病毒中的串联表达'>5.1 EG95-（C3d）₃基因在杆状病毒中的串联表达
• 5.2 细粒棘球蚴EG95s基因的单克隆抗体制备
• 5.3 细粒棘球蚴基因的原核与真核表达产物的比较
• 参考文献
• 致谢
• 作者简历