论文摘要
T淋巴细胞是介导适应性免疫应答的主要效应细胞，在各类免疫性疾病的发生及防治中发挥重要作用。通常情况下，在外来抗原的刺激下，T细胞迅速增殖扩增成为效应性T细胞；当抗原消失后，大部分细胞发生凋亡，小部分细胞分化成为记忆性T细胞，在再次免疫应答中发挥重要作用。然而，在慢性抗原持续刺激的情况下，如肿瘤，慢性感染性疾病以及自身免疫性疾病，抗原特异性T细胞会持续存在相当长的时间，同时伴随效应功能逐渐衰竭，最终成为耗竭性T细胞。耗竭性T细胞是一种效应性T细胞，其特征是细胞因子的表达减少，包括IFN-γ，TNF-α及IL-2等表达降低，以及细胞效应功能减弱，包括细胞毒性作用及细胞增殖等功能障碍。耗竭性T细胞免疫保护以及免疫监视等功能发生障碍，最终将导致慢性病原体感染性疾病以及肿瘤的发生。MicroRNAs （miRNAs）是存在于真核生物中的一类内源性的具有调控功能的非编码蛋白质的RNA，长约2025个核苷酸。miRNAs通过与靶mRNA3’UTR互补结合，诱导靶mRNA降解或抑制靶mRNA的翻译，从而实现转录后基因调控作用。目前共发现1000多个miRNAs，其中与免疫系统相关的就有100多个。miRNAs广泛参与各类免疫应答与多种生物学行为，如免疫细胞的分化发育、细胞的增殖与凋亡，并且在各类病原体感染性疾病、自身免疫性疾病以及多种肿瘤的发生发展中都发挥重要的调节作用。在众多miRNAs中，miR-155与免疫调控的关系最为密切。miR-155基因位于人类21号染色体B细胞非编码集合基因簇（BIC）的第三个外显子中。miR-155是第一个被报道与癌症相关的miRNAs。研究表明，miR-155与免疫细胞的发育分化密切相关。miR-155影响B细胞的成熟以及其转化成浆细胞分泌抗体的能力。miR-155调控T细胞的成熟，促进Th1及Th17细胞的分化。 miR-155参与Treg细胞的分化及其维持内环境稳定的功能。此外，miR-155广泛参与介导炎症性疾病及肿瘤的发生。总之，miR-155对免疫系统的调控具有复杂性和网络性，对不同的细胞类型、在细胞不同的分化阶段的调控都表现出明显的差异性，其具体机制还不是很清楚。此外，miR-155是否参与T细胞耗竭的过程，还未曾报道。阐明miR-155在T细胞耗竭中的作用及机制，可以进一步丰富对miR-155生物活性的认识，为研究及治疗其介导的慢性疾病提供新思路。【研究目的】1.利用抗原慢性持续性刺激小鼠模型，探索耗竭性CD4+T细胞的功能及其免疫调控机制。2.筛选并鉴定与CD4+T细胞耗竭相关的miRNAs，探讨其对CD4+T细胞耗竭的影响。3.鉴定在耗竭性CD4+T细胞中miR-155的靶标分子，并研究其在CD4+T细胞耗竭中的作用。4．利用实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，进一步研究miR-155与其靶标分子血红素加氧酶-1（HO-1）的相互调节作用。【研究方法】1. CD4+T细胞耗竭模型的建立及与CD4+T细胞耗竭相关miRNAs的筛选鉴定利用TcR转基因小鼠Rag2-/-Marilyn的CD4+T细胞作为供体细胞，此种T细胞的受体可以特异性识别雄性H-Y肽段。将雌性Rag2-/-Marilyn CD4+T细胞腹腔过继转移至雄性Rag2-/-IL-2Rγc-/-受体小鼠体内。过继转移21天后处死小鼠，从受体小鼠脾淋巴细胞中分离纯化Marilyn CD4+T细胞，采用miRNA芯片技术比较过继前后细胞miRNAs表达谱的变化。此外，收集受体小鼠脾混合淋巴细胞，并进行体外培养，同时加入抗PDL-1抗体阻断PD-1/PDL-1通路，初步探讨PD-1在CD4+T细胞耗竭中的作用。抗CD3/CD28抗体体外刺激过继的Marilyn CD4+T细胞，在与PD-1配体PDL-1Ig或同型Ig结合后，ELISA检测细胞培养上清中IFN-γ的变化。2. miR-155在CD4+T细胞耗竭中的作用及其机制研究分别过继转移miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞与miR-155+/+Marilyn CD4+T细胞至Rag2-/-IL-2Rγc-/-受体小鼠体内，并在过继转移后14天开始用抗PDL-1抗体体内阻断PD-1/PDL-1通路，每2天注射一次，21天后处死小鼠。采用免疫荧光染色技术，分析CD4+T细胞在各靶器官中的浸润变化；采用流式细胞技术分析脾Th细胞的应答变化；同时，利用ELISA技术检测体外培养脾混合淋巴细胞以及经anti-CD3/CD28刺激的CD4+T细胞，培养上清中IFN-γ分泌的变化；采用mRNA芯片技术对比过继的miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞与过继的miR-155+/+Marilyn CD4+T细胞mRNA表达谱的区别。通过对比分析mRNAs芯片结果与靶标预测软件结果，筛选miR-155的靶标。采用荧光定量PCR及western blot技术进一步鉴定miR-155的靶标。此外，应用RNA免疫共沉淀技术研究miR-155与AGO2形成的蛋白复合体与靶标mRNA之间的相互结合。在此基础上，通过双荧光素酶报告基因实验检测miR-155与靶标3’UTR之间的相互作用。3. HO-1对耗竭性miR-155-/-CD4+T细胞的作用及机制研究在确定血红素加氧酶-1（HO-1, encoded by Hmox1）是miR-155靶标的基础上，研究其功能。将miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞过继转移至Rag2-/-IL-2Rγc-/-受体小鼠体内，从过继前一天开始，每2天腹腔注射HO-1抑制剂ZnPP，同时设置对照组。21天后处死小鼠。采用免疫荧光染色技术，分析ZnPP处理组与对照组miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞在受体小鼠各靶器官的浸润变化；采用流式细胞技术分析受体小鼠脾中Th细胞应答变化。将经抗CD3/CD28抗体刺激的初始性miR-155-/-CD4+T细胞与ZnPP体外共培养，ELISA检测培养上清中IL-2及IFN-γ的分泌情况。4. HO-1在小鼠EAE模型中的作用及机制的初步探讨利用小鼠EAE模型研究HO-1的功能。共设置以下4组小鼠实验：B6+Vehicle对照组；B6+CoPP组；miR-155-/-+Vehicle对照组；miR-155-/-+ZnPP组。从MOG35-55皮下免疫第一天开始，每2天腹腔注射HO-1诱导剂CoPP或HO-1抑制剂ZnPP，同时设置Vehicle对照组。每天进行EAE评分，免疫后23天宰杀小鼠，分别取脾，腹股沟淋巴结，脑组织淋巴细胞。用流式细胞技术检测CD3+，B220+，CD11b+细胞的浸润情况以及Th细胞应答的变化。【研究结果】1.过继的Marilyn CD4+T细胞基因表达谱与耗竭性CD8+T细胞的基因表达谱相似。PD-1可以调控耗竭性CD4+T细胞的功能，抗PDL-1抗体体内阻断PD-1/PDL-1信号通路后，Marilyn CD4+T细胞在受体小鼠的脾，结肠，肺，肝脏，肾脏等器官中的浸润明显增加。体外抗PDL-1抗体阻断后，可以恢复耗竭性Marilyn CD4+T细胞分泌IFN-γ的功能。在TCR与PD-1交联的情况下，耗竭性Marilyn CD4+T细胞IFN-γ的分泌受到抑制。2. miRNA芯片的结果显示，耗竭性Marilyn CD4+T细胞伴随miR-155高表达。过继转移21天后，miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞在受体小鼠的脾，结肠，肺，肝脏，肾脏器官中的浸润程度以及脾中Th1细胞应答明显少于miR-155+/+Marilyn CD4+T细胞。体外经anti-CD3/CD28刺激后，过继的miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞IFN-γ的分泌显著少于miR-155+/+Marilyn CD4+T细胞。过继的miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞同样表达PD-1，但是与过继的miR-155+/+Marilyn CD4+T细胞不同的是，抗PDL-1抗体体内及体外阻断PD-1/PDL-1信号通路并不能恢复耗竭性miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞的增殖及IFN-γ分泌功能。通过分析对比mRNA芯片结果与MicroCosm计算方法预测结果，Hmox1是miR-155潜在靶点。荧光定量PCR及western blot结果进一步证实了HO-1在耗竭性miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞高表达。在此基础上，双荧光素酶报告基因荧光素酶活性检测结果为：miR-155Mimic与Hmox13’UTR荧光报告载体共转染HEK293T细胞组相对荧光素酶活性比miRNA Mimic control和Hmox13’UTR荧光报告载体共转染组明显降低。RNA免疫共沉淀实验结果表明，miR-155与AGO2形成蛋白复合体并结合Hmox1mRNA导致其表达降低。3. ZnPP处理后，受体小鼠脾总淋巴细胞数以及miR-155-/-Marilyn CD4+T细胞的数量都明显高于Vehicle对照组。免疫荧光染色的结果显示：在结肠，肺，肝脏，肾脏，ZnPP处理组的miR-155-/-Mariyln CD4+T细胞浸润明显增加。但是ZnPP处理组与Vehicle对照组相比，Th1细胞应答并没有明显差异。抗CD3/CD28抗体刺激的初始性miR-155-/-CD4+T细胞，体外ZnPP处理将增加IL-2的分泌。4.在诱导EAE的4组小鼠模型中，B6组小鼠全部发病，免疫后14天开始发病，20天左右达高峰；在B6小鼠中，CoPP处理组临床评分明显低于Vehicle对照组小鼠；在miR-155-/-小鼠中，Vehicle对照组小鼠只有少数小鼠发病，平均临床评分<0.5分，ZnPP处理组小鼠临床评分高于Vehicle对照组。此外，流式细胞技术检测发现，miR-155-/-对照组高峰期小鼠中枢神经组织中CD3+，CD11b+及B220+细胞浸润明显少于其他组，而在脾及腹股沟淋巴结中，4组之间细胞浸润则无显著差异。在中枢神经组织中，miR-155-/-组的Th1及Th17细胞应答明显少于miR-155+/+组，当注射ZnPP后，miR-155-/-组Th1及Th17细胞应答水平显著增加。【主要结论】1.慢性持续性抗原刺激可以诱导CD4+T细胞耗竭。耗竭性CD4+T细胞高表达Th1细胞相关基因以及抑制性共刺激分子。在抑制性共刺激分子中，PD-1表达最高，并且PD-1可以调控耗竭性CD4+T细胞的增殖，IFN-γ的分泌等免疫活性。2.耗竭性CD4+T细胞伴随miR-155高表达。耗竭性miR-155-/-CD4+T细胞的增殖能力及Th1细胞应答明显弱于耗竭性miR-155+/+CD4+T细胞。miR-155对于CD4+T细胞耗竭并不是必需的，但是阻断PD-1/PDL-1信号通路恢复耗竭性T细胞免疫功能需要有miR-155的表达。3.在CD4+T细胞耗竭模型中，Hmox1是miR-155的靶基因。HO-1可以调控耗竭性miR-155-/-CD4+T细胞的增殖功能。4.抑制HO-1的活性可以恢复miR-155-/-小鼠对EAE的易感性，并且伴随中枢神经系统CD3+细胞浸润以及Th1/Th17细胞应答增加。【研究意义】1.本研究成功构建了CD4+T细胞耗竭模型。运用mRNAs芯片与miRNAs芯片技术全面分析了耗竭性CD4+T细胞的表达谱，为深入研究T细胞耗竭奠定了基础。2.首次全面阐述了Hmox1是miR-155的一个新靶标，为了解研究miR-155的生物活性及功能提供了新线索。3.本研究初步探讨HO-1与miR-155在T细胞耗竭中的相互调控机制，为研究及治疗相关疾病，如：肿瘤，慢性感染性疾病等提供新思路。HO-1可能成为治疗相关疾病的新靶点。