促肝细胞生长素对化学性肝损伤小鼠肝脏和H2O2损伤LO2细胞的保护作用及其初探

论文摘要

目的初步研究促肝细胞生长素（PHGF）对化学性肝损伤小鼠肝脏以及过氧化氢损伤的L02肝细胞的保护作用及其机制,为明确促肝细胞生长素的临床使用提供一定的理论依据。方法本课题分为体内体外两部分：（1）体内法。首先对PHGF的分子量进行电泳分析,接着按照《国家药品标准》第九册（WS-10001 （HD-0828）-2002）中促肝细胞生长素活性测定法检测其生物学活性；然后采用灌胃四氯化碳制造小鼠化学性肝损伤模型。试验分为六组。空白对照组,模型组,三个PHGF剂量组（12.5、25、50 mg·kg-1）和一个阳性对照组（永宁肝保胶囊）。小鼠给药一周,依法进行造模后,取血清测定各组小鼠ALT和AST的值；取肝脏进行病理组织学检查并用免疫组化检测Bcl-2和Bax蛋白的表达；运用Western blot法检测各组小鼠肝组织Bcl-2和Bax蛋白的表达。（2）体外法。首先采用MTT法检测PHGF对正常L02细胞的影响,以考察其细胞毒性。并采用过氧化氢（H202）制造L02细胞体外凋亡模型,研究PHGF对H202损伤的L02细胞的保护作用和机制。试验分为5组。空白对照组,H202组和三个PHGF浓度组（50、100、200μg·mL-1）。采用MTT法检测PHGF对不同组别L02细胞存活率的影响；应用流式细胞术检测不同组别L02细胞凋亡变化,运用Western blot法检测各组L02细胞内目标蛋白的表达情况。结果体内试验表明：PHGF各给药组ALT与AST的值要明显低于模型组（P<0.05）；病理切片观察,各给药组的肝组织细胞坏死情况明显好于模型组；免疫组化实验表明,PHGF各给药组Bcl-2蛋白的表达明显高于模型组（P<0.05）,而Bax蛋白的表达明显低于模型组（P<0.05）；Westernblot实验表明：PHGF各剂量组,按剂量从高到低,Bcl-2蛋白的表达明显高于模型组（P<0.01）,而Bax蛋白的表达明显低于模型组（P<0.01）。体外试验表明：PHGF对正常L02细胞在一定的浓度范围内（50·02.5μg·mL-1）无明显增殖作用也无明显细胞毒作用,通过实验表明,H202对L02细胞造模的最佳浓度为0.25mmoL·L-1；PHGF对H2O2诱导的L02细胞损伤MTT试验结果表明,各浓度组光密度值显著高于H202组（P<0.05）；流式细胞术结果表明：PHGF各浓度组L02细胞凋亡率显著低于H202组（P<0.01）；Western blot实验表明：PHGF各浓度组,按浓度从高到低,Bcl-2蛋白的表达明显高于H202组（P<0.01）,而Bax蛋白的表达明显低于H202组（P<0.01）。结论促肝细胞生长素对四氯化碳引起的小鼠化学性肝损伤以及过氧化氢造成的L02细胞凋亡具有一定的保护作用,其作用机制可能与其增加Bcl-2蛋白的表达以及减少Bax蛋白的表达有关。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 第一章 文献综述
• 1.1 肝损伤的研究背景
• 1.2 肝损伤与肝细胞死亡
• 1.2.1 线粒体与肝损伤
• 1.2.2 Bcl-2、Bax与肝损伤
• 1.2.3 Fas/Fasl系统与肝损伤
• 1.2.4 保肝药物与肝损伤
• 1.3 肝细胞生长刺激因子的生物学背景
• 1.4 肝细胞生长因子
• 1.4.1 HGF的结构及理化特性
• 1.4.2 HGF的基因表达与受体
• 1.4.3 HGF的生物学特性
• 1.4.3.1 HGF与肝再生
• 1.4.3.2 HGF抗纤维化作用
• 1.4.3.3 HGF对肿瘤的作用
• 1.4.3.4 HGF对其他器官组织的作用
• 1.4.4 HGF的临床应用与前景
• 1.5 促肝细胞生长因子（PHGF）的发现
• 1.5.1 PHGF的结构及理化特性
• 1.5.2 PHGF的生物学特性
• 1.5.3 PHGF其他生物学作用的研究进展
• 1.5.4 PHGF的临床应用与前景
• 4诱导的肝损伤小鼠肝脏的保护作用和机制研究'>第二章 促肝细胞生长素对CCl₄诱导的肝损伤小鼠肝脏的保护作用和机制研究
• 前言
• 2.1 材料和主要仪器
• 2.1.1 实验动物和细胞株
• 2.1.2 主要实验药品及试剂
• 2.1.3 主要仪器
• 2.2 方法
• 2.2.1 PHGF质量标准研究
• 2.2.1.1 PHGF分子量电泳分析
• 2.2.1.2 PHGF生物学活性检测
• 2.2.2 实验动物分组
• 2.2.3 实验动物造模
• 2.2.4 标本采集
• 2.2.5 小鼠血清ALT和AST检测
• 2.2.6 病理组织学检查
• 2.2.7 免疫组化法检测小鼠肝组织Bcl-2与Bax的表达
• 2.2.7.1 石蜡切片制作
• 2.2.7.2 免疫组化法检测小鼠肝组织Bax和Bcl-2的表达
• 2.2.8 Western blot法检测小鼠肝组织Bcl-2与Bax蛋白的表达
• 2.2.8.1 肝组织蛋白样品制备
• 2.2.8.2 BCA法测定蛋白浓度
• 2.2.8.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.8.4 转膜
• 2.2.8.5 封闭
• 2.2.8.6 孵育一抗
• 2.2.8.7 洗膜
• 2.2.8.8 孵育二抗
• 2.2.8.9 洗膜
• 2.2.8.10 ECL化学显影
• 2.3 试验结果
• 2.3.1 PHGF分子量电泳分析结果
• 2.3.2 PHGF生物学活性检测
• 2.3.3 小鼠血清ALT与AST检测结果
• 2.3.4 小鼠肝组织HE染色检测结果
• 2.3.5 小鼠肝组织Bcl-2与Bax免疫组化染色结果
• 2.3.6 小鼠肝组织Bcl-2与Bax蛋白的表达Western blot检测结果
• 2.3.6.1 标准曲线
• 2.3.6.2 蛋白浓度计算
• 2.3.6.3 Western blot实验结果
• 2.4 结论
• 2O₂诱导的LO2细胞凋亡的保护作用和机制研究'>第三章 促肝细胞生长素对H₂O₂诱导的LO2细胞凋亡的保护作用和机制研究
• 前言
• 3.1 材料和主要仪器
• 3.1.1 细胞株
• 3.1.2 主要实验药品及试剂
• 3.1.3 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 细胞的培养
• 3.2.2 MTT法检测PHGF对正常LO2细胞的影响
• 2O₂浓度的确定'>3.2.3 H₂O₂浓度的确定
• 3.2.4 细胞模型的建立
• 2O₂诱导的LO2细胞增殖的影响'>3.2.5 MTT法检测PHGF对H₂O₂诱导的LO2细胞增殖的影响
• 2O₂诱导的LO2细胞凋亡的影响'>3.2.6 PHGF对H₂O₂诱导的LO2细胞凋亡的影响
• 3.2.6.1 Hoechst染色
• 3.2.6.2 流式细胞术基本原理
• 3.2.6.3 流式细胞术实验步骤
• 3.2.6.4 流式细胞术结果判断
• 2O₂诱导的LO2细胞Bcl-2与Bax蛋白的表达'>3.2.7 Western blot法检测PHGF对H₂O₂诱导的LO2细胞Bcl-2与Bax蛋白的表达
• 3.2.7.1 LO2细胞蛋白样品制备
• 3.2.7.2 BCA法测定蛋白浓度
• 3.2.7.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.2.7.4 转膜
• 3.2.7.5 封闭
• 3.2.7.6 孵育一抗
• 3.2.7.7 洗膜
• 3.2.7.8 孵育二抗
• 3.2.7.9 洗膜
• 3.2.7.10 ECL化学显影
• 3.3 试验结果
• 3.3.1 PHGF对正常LO2细胞的影响
• 2O₂浓度的确定'>3.3.2 H₂O₂浓度的确定
• 2O₂诱导的LO2细胞增殖率的影响'>3.3.3 PHGF对H₂O₂诱导的LO2细胞增殖率的影响
• 2O₂诱导LO2细胞凋亡的影响'>3.3.4 PHGF对H₂O₂诱导LO2细胞凋亡的影响
• 3.3.4.1 Hoechst染色结果
• 3.3.4.2 流式细胞术结果
• 2O₂诱导LO2细胞Bcl-2与Bax蛋白表达Western blot检测结果'>3.3.5 PHGF对H₂O₂诱导LO2细胞Bcl-2与Bax蛋白表达Western blot检测结果
• 3.3.5.1 标准曲线
• 3.3.5.2 蛋白浓度计算
• 3.3.5.3 Western blot实验结果
• 3.4 结论
• 第四章 讨论与结论
• 4.1 讨论
• 4.1.1 肝损伤模型
• 4所致肝损伤背景介绍'>4.1.2 CCl₄所致肝损伤背景介绍
• 4所致肝损伤模型的实验研究'>4.1.3 PHGF对CCl₄所致肝损伤模型的实验研究
• 4.1.3.1 PHGF
• 4所致化学性肝损伤小鼠肝细胞的保护作用'>4.1.3.2 PHGF对CCl₄所致化学性肝损伤小鼠肝细胞的保护作用
• 4.1.3.3 PHGF对不同给药组小鼠肝组织Bcl-2与Bax蛋白表达的影响
• 2O₂诱导的LO₂细胞凋亡的影响'>4.1.4 PHGF对H₂O₂诱导的LO₂细胞凋亡的影响
• 2O₂与细胞凋亡'>4.1.4.1 H₂O₂与细胞凋亡
• 4.1.4.2 PHGF对正常LO2细胞的影响
• 2诱导的LO2细胞凋亡的影响'>4.1.4.3 MTT法检测PHGF对H2O₂诱导的LO2细胞凋亡的影响
• 4.1.4.4 PHGF对LO2细胞凋亡的影响
• 4.1.4.5 PHGF对不同给药组LO2细胞Bcl-2与Bax蛋白表达的影响
• 4.2 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读硕士学位期间发表论文情况