乳酸菌对小鼠派伊尔结黏附作用机制研究

论文摘要

派伊尔结（Peyer’s patch,PP）是肠道黏膜免疫系统的重要部位,是乳酸菌进入肠黏膜免疫诱导部位的主要通道。本课题研究乳酸菌黏附PP的性质及影响因子,有助于阐明乳酸菌调节黏膜免疫的机制,也将为乳酸菌免疫调节制剂的开发提供理论依据。试验先用小鼠PP组织切片为黏附基质,研究了10株乳酸菌的粘附性,结果显示,嗜酸乳杆菌（L. acidophilus,LA）黏附PP的能力最强。利用细菌黏附正十六烷法测定了乳酸菌表面疏水性,结果表明,10株乳酸菌的表面疏水性与粘附性呈负相关趋势。酵母凝集和红细胞凝集试验分析了乳酸菌细胞表面凝集素的表达情况,结果表明,乳酸菌的凝集性与粘附性呈正相关趋势,LA的凝集活性最强。利用红细胞凝集试验和凝集抑制（HIA）试验分析了LA凝集素的性质,结果表明,LA和Escherichia coli（对照）均能引起猪和兔红细胞凝集,说明其细胞表面可能存在凝集素样物质。LA和E.coli经高碘酸钾,SDS,LiCl,胃蛋白酶、胰蛋白酶处理后,其凝集性显著降低,表明LA的凝集素样物质为糖蛋白类。用11种糖进行HIA试验,结果显示,LA和E.coli的凝集反应主要被甘露糖、半乳糖抑制。兔红细胞经半乳糖苷酶修饰后,E.coli对其的凝集活性完全丧失,而LA的凝集活性不受影响,表明甘露糖、半乳糖是两种菌表面凝集素的特异性糖,半乳糖不是LA表面凝集素的主要特异性糖。为了进一步定量的分析介导LA黏附PP的物质,建立了一种准确、简单、高效的微生物粘附性荧光定量检测方法,用FITC标记的乳酸菌与PP组织块在96孔组织培养板进行黏附试验,洗去未结合细菌,消化组织,通过荧光值评价细菌黏附量,最佳检测条件为:黏附时间1h,黏附温度37℃,黏附后洗板次数3次,黏附细菌浓度1×109CFU/mL;消化时间为18h,消化温度为70℃,消化液浓度1%（Triton X-100+KOH）。黏附试验结果显示,甘露糖、α-甲基-D-甘露糖苷可显著抑制LA黏附PP,结合红细胞凝集试验结果,可知介导LA凝集PP的物质为甘露糖特异性凝集素。拮抗黏附试验结果显示,LA活菌、热灭活菌均能抑制E.coli、Salmonella和Shigella黏附PP,热灭活菌抑制E.coli的能力强于活菌。说明,LA黏附PP的部分黏附位点与E.coli相似,可能通过竞争黏附位点抑制E.coli等病原菌黏附PP。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 引言
• 1.2 乳酸菌对机体免疫的调节作用
• 1.3 肠道黏膜免疫
• 1.3.1 肠道黏膜免疫的重要性
• 1.3.2 肠道黏膜免疫的特点
• 1.3.3 肠道黏膜免疫反应的诱导过程
• 1.4 黏附理论
• 1.4.1 乳酸菌粘附性
• 1.4.2 乳酸菌黏附的宿主特异性与菌种特异性学说
• 1.5 黏附机理
• 1.5.1 非特异性黏附
• 1.5.2 特异性黏附
• 1.6 乳酸菌抑制肠道病原菌的作用
• 1.7 立题意义及研究思路
• 第二章 乳酸菌表面性质及对小鼠PP 黏附的影响
• 2.1 引言
• 2.2 材料与方法
• 2.2.1 试验材料
• 2.2.2 主要仪器
• 2.2.3 乳酸菌黏附PP 试验
• 2.2.4 黏附影响因子试验
• 2.2.5 统计与分析
• 2.3 结果分析
• 2.3.1 乳酸菌黏附PP、非FAE 上皮的性质
• 2.3.2 乳酸菌表面物理化学特性、酵母、红细胞凝集性的关系
• 2.3.3 各种糖对LA 黏附PP 的影响
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 第三章 乳酸菌黏附影响因素的研究
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 试验材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.2.3 细菌悬浮液的制备
• 3.2.4 红细胞悬浮液的制备
• 3.2.5 红细胞凝集试验
• 3.2.6 红细胞凝集抑制试验
• 3.2.7 细菌经化学试剂或酶处理的凝集试验
• 3.2.8 修饰后红细胞的凝集试验
• 3.2.9 统计分析
• 3.3 结果分析
• 3.3.1 红细胞来源对细菌凝集素活性的影响
• 3.3.2 化学试剂或酶处理对细菌的红细胞凝集素活性的影响
• 3.3.3 红细胞修饰对细菌凝集素活性的影响
• 3.3.4 红细胞凝集糖抑制试验
• 3.4 讨论
• 3.5 本章小结
• 第四章 黏附荧光检测法的建立及黏附影响因子的研究
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 试验材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.2.3 小鼠PP 组织的制备
• 4.2.4 细菌培养
• 4.2.5 不同荧光素浓度对标记效果的影响
• 4.2.6 细菌浓度和荧光值相关曲线的建立
• 4.2.7 黏附试验及其条件的优化
• 4.2.8 消化试验条件的优化
• 4.2.9 细菌黏附PP 量与细菌原始浓度的相关性
• 4.2.10 黏附影响因素的研究
• 4.2.11 数据统计分析
• 4.3 结果
• 4.3.1 荧光素浓度的选择
• 4.3.2 荧光值和细菌浓度相关性曲线
• 4.3.3 黏附试验条件的优化
• 4.3.4 消化试验条件的优化
• 4.3.5 细菌黏附PP 量与细菌原始浓度的相关性
• 4.3.6 黏附影响因素的研究
• 4.4 讨论
• 4.5 本章小结
• 第五章 嗜酸乳杆菌（LA）对致病菌的拮抗作用
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 试验材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.2.3 LA 和致病菌的培养与制备
• 5.2.4 致病菌的荧光标记
• 5.2.5 LA 对致病菌的体外拮抗作用试验
• 5.2.6 LA 对致病菌的体内拮抗作用试验
• 5.2.7 数据的统计与分析
• 5.3 结果
• 5.3.1 两种生物状态LA 对PP 黏附作用
• 5.3.2 两种生物状态LA 对肠道致病菌的体外黏附拮抗作用
• 5.3.3 两种生物状态LA 对肠道致病菌的体内拮抗作用
• 5.4 讨论
• 5.5 本章小结
• 论文主要结论
• 致谢
• 参考文献
• 附录：攻读硕士学位期间发表的论文