水稻耐铝毒QTL分析与精细定位

论文摘要

本研究利用Kinmaze／DV85重组自交系群体、Nipponbare／Kasalath回交重组自交系群体以及其置换系群体、Asominori／IR24重组自交系群体和以IR24为背景的Asominori染色体片段置换系群体进行了耐铝毒QTLs分析。并在第9染色体上定位了一个稳定表达的耐铝毒QTL。据此，利用目标QTL对应的置换系与背景亲本杂交构建次级F2群体，将稳定表达的QTL分解为单基因，并精细定位，为水稻抗铝毒QTL图位克隆奠定基础。主要结果如下：1利用重组自交系群体检测水稻耐铝毒QTLs利用Kinmaze／DV85 81个重组自交家系（RIL）作图群体，采用苗期单营养液水培鉴定方法，以相对根伸长量（RRE）作为耐铝毒性状的表型值，分析亲本和重组自交系群体对铝毒的耐性表现。利用Windows QTL Cartographer软件共检测到5个耐铝毒QTLs，分别位于第1、5、8、9和11染色体上，各个QTL的贡献率在8.64％～18.60％之间，其中，位于第5、8和11染色体上的QTLs对铝毒的抗性基因来自亲本DV85，位于第1和9染色体上的QTLs对铝毒的抗性基因来自亲本Kinmaze。结合前人研究结果，讨论了稳定表达的耐铝毒基因座，为进一步水稻耐铝毒分子标记辅助选择育种和耐铝毒基因的图位克隆奠定了基础。2利用回交重组自交系群体检测水稻耐铝毒相关性状QTLs利用98个株系组成的Nipponbare（japonica）／Kasalath（indica）∥Nipponbare（japonica）回交重组自交系（backcross inbred lines，BIL）群体，采用苗期水培鉴定方法，测定了亲本及98个BILs在对照根伸长量、处理根伸长量以及由此计算得到的相对根伸长量。三个性状总共检测到7个QTLs，其中对照根伸长量分别在第6、8和9染色体上检测到3个QTLs；处理根伸长量在第4染色体上检测到1个QTL；相对根伸长量分别在第5、9和10染色体上检测到3个QTLs。位于9和10染色体上的qRRE-9和的贡献率为9.7％和11.8％，对铝毒耐性的增效等位基因来自Nipponbare；位于第5染色体的qRRE-5的贡献率为9.8％，增效等位基因来自Kasalath。相对根伸长量检测的3个QTL中qRRE-5显示与玉米第6染色体上的一个耐铝毒主基因正同源。另一个qRRE-9在染色体上的位置与先前利用不同群体报道的耐铝毒QTL位置相近。在第9染色体上检测到对照根伸长量和相对根伸长量共有的QTL也表明此QTL的候选基因的功能可能与根生长速率相关。而qRRE-10为新检测到的耐铝毒基因座。同时，利用对应的置换系我们验证了这些QTLs的功能。这些结果为通过分子标记辅助选择和聚合QTLs来增进水稻铝毒耐性提供了可能。3水稻耐铝毒QTL分析与精细定位（1）利用Asominori×IR24的重组自交系群体在2004年检测水稻耐铝毒QTLs，结果发现重组自交系群体在相对根伸长量的次数分布图呈现正态分布，并出现双向超亲遗传现象；分别在第1、9、11染色体上检测到一个耐铝毒加性效应QTL；其中位于第9染色体上的QTL qRRE-9在不同的群体中都重复出现，该QTL的稳定表达的QTL。利用以IR24为遗传背景的全基因组片段置换系（CSSL）群体的相关株系，验证了上述QTLs等位基因的功能和表达稳定性。在水稻中新检测到的qRRE-11也显示与玉米第10染色体上存在的一个主效的耐铝毒基因相一致。（2）利用QTL qRRE-9对应的1个置换系CSSL51与IR24回交和自交，构建次级F2群体（192个单株，2004年南京）及其F3群体（192个株系，2005年南京），将QTL qRRE-9分解为单基因（Alt-9）。应用6对SSR引物，结合CSSL51×IR24次级F2群体192个单株的分子数据和F2、F3群体的耐铝毒表型数据，将Alt-9基因定位在SSR标记RM553和RM215之间。2005年在南京，将CSSL51×IR24次级F2群体扩大到1043个单株。利用本研究中开发的SSR标记和InDel标记和Zhang QF等（1994）“隐性极端个体基因作图”的分析方法，调查224个耐铝毒极端个体的分子数据，将Alt-9基因精细定位在RM24702和ID47-2之间，距离RM24702和ID47-2分别为0.90 cM，并与该区间中的SSR标记RM5765共分离。4 T-DNA插入产生的水稻铝毒敏感突变体的遗传分析通过筛选水稻T-DNA插入突变体，获得一个铝毒敏感的突变体。在100μM Al3+浓度下，野生型亲本Nipponbare的根伸长被抑制了34％，而突变体根伸长量被抑制59％。对该铝毒敏感突变体进行遗传分析的结果表明，分离群体后代中出现铝毒敏感：耐铝毒分离比率为3∶1，表明控制耐铝毒的基因是一个隐性单基因。对突变体及其后代分离群体做Basta和潮霉素抗性检测及PCR分子检测，证实该突变体是由T-DNA插入所引起的，突变表型与T-DNA共分离。该材料可用于插入座位的基因克隆。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章:引论
• 第一节 铝毒研究概述
• 1.酸性土壤和铝毒
• 1.1 酸性土壤
• 1.2 环境中铝的化学形态
• 2.铝对植物的毒害
• 2.1 植物铝毒症状
• 2.2 植物根系中铝毒害的位置
• 2.3 铝毒对营养元素吸收、转运和利用的影响
• 2.4 铝毒对细胞壁的影响
• 2.5 铝毒对细胞膜的影响
• 2.5 铝对生物大分子的影响
• 3.植物对铝毒耐性机制
• 3.1 外部耐铝机理
• 3.2 内部抗铝机理
• 第二节 水稻耐铝毒分子数量遗传研究进展
• 1.分子数量遗传研究的原理、方法与应用
• 1.1 分子标记连锁图谱的构建
• 1.2 QTL初步定位的原理和方法
• 1.3 QTL的单基因分解、精细定位和图位克隆
• 1.4 QTL定位研究的育种应用
• 2.水稻耐铝毒QTL定位的研究进展
• 2.1 植物耐铝毒的遗传分析
• 2.2 水稻耐铝毒QTL定位结果的比较
• 2.3 水稻耐铝毒的分子生物学研究
• 第三节 水稻T-DNA变体研究概况
• 第四节 本研究的目的意义、内容
• 第二章 利用Kimaze/DV85重组自交系定位水稻耐铝毒QTLs
• 1.材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 田间种植
• 1.3 耐铝性鉴定
• 1.4 统计分析
• 2.结果与分析
• 2.1 两种检测方法的比较
• 2.2 亲本Kinmaze与DV85及其重组自交系群体的耐铝毒表现
• 2.3 水稻耐铝毒QTL的定位
• 3.讨论
• 3.1 相对根伸长量（RRE）可作为准确快速的耐铝毒评价指标
• 3.2 不同群体水稻耐铝毒数量性状基因座的比较分析
• 第三章 利用回交重组自交系群体定位水稻耐铝毒相关性状QTLs
• 1.材料和方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 田间种植
• 1.3 单营养液水培检测方法（相对根伸长量法）
• 1.4 统计分析
• 2.结果
• 2.1 浓度梯度实验
• 2.2 亲本和群体株系表型
• 2.3 耐铝毒QTL定位
• 2.4 利用置换系验证QTLs功能
• 3.讨论
• 第四章 水稻耐铝毒QTL分析与精细定位
• 1.材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 田间种植
• 1.3 表型鉴定
• 1.4 DNA样品备制与SSR分析
• 1.5 数据分析
• 2.结果与分析
• 2.1 亲本铝胁迫浓度梯度表型变异
• 2.2 亲本和群体耐铝毒表型变异
• 2.3 耐毒QTLs分析
• 2.4 利用CSSL群体验证水稻耐铝毒QTLs的功能
• 2.5 水稻耐铝毒主效QTL qRRE-9的单基因分解
• 2.6 水稻耐铝毒单隐性基因AlT-9的精细定位
• 3.讨论
• 3.1 控制水稻铝毒基因的不同群体研究结果比较及QTLs功能验证
• 3.2 全基因组染色体片段置换系是深入剖析数量性状遗传基础的理想材料
• 3.3 后基因组时代水稻基因的精细定位
• 第五章 铝毒敏感T-DNA插入突变体的鉴定和遗传分析
• 1.材料与方法
• 1.1 试验材料
• 1.2 单营养液培养法
• 1.3 Basta抗性鉴定
• 1.4 转基因水稻叶片的潮霉素抗性鉴定
• 1.5 DNA样品制备和PCR检测
• 2.结果与分析
• 2.1 铝毒敏感突变体的性状特征
• 2.2 突变性状的遗传
• 2.3 突变性状与T-DNA的关系
• 3.讨论
• 第六章 全文小结
• 1.全文结论
• 1.1 水稻耐铝毒QTLs分析
• 1.2 水稻耐铝毒QTL稳定性分析、单基因分解与精细定位
• 1.3 水稻铝毒敏感T-DNA插入突变体的鉴定和遗传分析
• 2.本研究的创新之处
• 2.1 研究材料与统计方法的创新
• 2.2 研究结果的创新
• 2.3 水稻耐铝毒QTL深入研究策略的创新
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表（投稿）的论文