有机磷农药残留酶—光学偶联传感器的研制和有机氯农药脱卤素酶的定向运输

论文摘要

农业生产过程中农作物经常会受到害虫的侵害使得产量下降,经济遭受严重损失。目前对付植物害虫的方法多为化学方法,常用的化学杀虫剂包括有机磷、有机氯和氨基甲酸酯类等。有机磷化合物占到了全球杀虫剂使用总量的38%,仅在美国,每年就使用了4万吨的有机磷农药,另外每年还有两万吨被用于出口。有机磷农药在环境中降解半衰期一般在几周到几个月,残毒低。但对于一些高毒品种和一些代谢毒性更强的化合物,仍会引起慢性中毒。由于施用量大,加之违章操作,农药残留超标问题十分突出。目前检测有机磷农药残留的方法由于操作复杂、耗时长、成本高等原因,不利于现场的即时检测。有机氯农药作为一种广谱杀虫剂曾经被普遍使用,但由于这类农药脂溶性高,化学性质稳定,难于降解,是一种持久性的有机污染物,1983年我国已开始禁止使用,但在土壤、水以及空气中仍被检出有机氯农药。本研究主要探讨了有机磷农药残留检测的酶—光学偶联生物传感器的开发和有机氯农药六六六生物降解过程中的关键酶—脱卤素酶的定位运输。1.光学传感器的制作将甲基对硫磷水解酶mpd基因整合到表达载体pET30a中,构建末端有6个组氨酸标签的融合表达载体pETM,利用T7噬菌体启动子,实现在宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。超声波破碎获得细胞溶解物,用Ni-NTA层析柱对目标蛋白进行纯化,得到高纯度的有机磷水解酶（MPH）。将纯化后的MPH固定到Ni-NTA基质上,再用一定的特定孔道滤纸将基质固定到分隔开的小池内,实现了酶的固定和反应池的制作。若酶失活后,可以用高浓度的咪唑溶液将酶洗脱下来,重新固定新鲜有活性的酶,实现固定化酶的再生。甲基对硫磷的水解产物对硝基酚在410 nm处有特定的吸光值,测定反应前后吸光值的变化,由对硝基酚的生成浓度可监测甲基对硫磷的含量变化。配制一定已知浓度的甲基对硫磷溶液,测定反应后的特定吸光值的变化,可得到响应曲线。该检测装置的最低响应浓度为0.2 mg/L,是一种高效、快速、低成本、易于操作的光学生物传感器。2.六六六脱卤素酶LinA的定位运输Tat转运系统是在植物叶绿体和原核生物细胞中发现的一种蛋白分泌系统。被转运的蛋白质信号肽上含有双精氨酸保守序列S/TRRxFLK。与Sec转运系统不同的是,前者被转运的蛋白最终以折叠过的形式释放,后者蛋白没有被折叠,因此后者一般没有生物活性。在Tat转运系统中,经常将其信号肽序列TorA整合在蛋白的N端。linA编码六六六有氧降解中的脱卤素酶,介导了其脱卤素反应的前两步,在本研究中,我们利用tat转运系统进行了融合蛋白LinA-EGFP的细胞周质空间的转运。构建了编码TorA-LinA-EGFP融合蛋白的表达载体pUTLAEG,在大肠杆菌MC4100中诱导表达。通过Western蛋白印记、荧光观察以及对细胞周质空间提取物、细胞质破碎物、全细胞进行了LinA活性的测定,证实带有信号肽的融合蛋白被运输到了细胞的周质空间中。

论文目录

• 目录
• 摘要
• Abstract
• 缩略词
• 第一章 有机磷农药残留酶—光学偶联传感器的研制
• 1 前言
• 1.1 有机磷农药的毒理学和环境污染现状
• 1.2 有机磷农药残留的监测分析方法
• 1.3 酶的固定化研究进展
• 1.4 本研究的目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 MPH的诱导表达和纯化
• 2.4 有机磷水解酶活性的测定
• 2.5 Bradford法测定蛋白浓度
• 2.6 传感器的研制
• 3 结果与分析
• 3.1 MPH的诱导表达和纯化
• 3.2 MPH活性的测定
• 3.3 蛋白浓度的测定
• 3.4 固定化酶传感器的研制
• 4 讨论
• 第二章 有机氯农药脱卤素酶的定向运输
• 1 前言
• 1.1 持久性有机污染物
• 1.2 生物降解和生物修复
• 1.3 六六六生物降解的研究进展
• 1.4 细胞表面定位系统
• 1.5 报告基因
• 1.6 目的及意义
• 2 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 主要仪器
• 2.3 表达载体的构建
• 2.4 融合蛋白的表达和定位
• 2.5 脱卤素酶活性的测定
• 2.6 荧光检测
• 3 结果与分析
• 3.1 质粒的构建
• 3.2 蛋白的表达
• 3.3 酶活的测定
• 3.4 荧光检测
• 4 讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢