HECT家族泛素连接酶Wwp2泛素化修饰RNA聚合酶II大亚基Rpb1

论文摘要

RNA聚合酶II是在真核生物中负责转录和加工mRNA的聚合酶,由12个亚基组成,最大的亚基Rpb1是其主要的功能亚基,决定了转录的起始和延伸。Rpb1存在多种翻译后修饰,如磷酸化、糖基化和泛素化。以往的研究发现,Rpb1的泛素化修饰除参与其正常生理状态下的蛋白质代谢外,还可促进转录过程中停滞在DNA上的Rpb1的降解,以及促进大规模DNA损伤时的转录耦联修复（Transcription Coupled Repair,TCR）。因此,Rpb1的泛素化修饰通过严密调控Rpb1的活性蛋白水平,保证了转录的正常进行,并对DNA损伤修复和保证遗传物质的稳定性、保真性有重要意义。Rpb1的泛素化修饰对调节其活性可能也有重要作用。但目前仅有两个参与DNA损伤时Rpb1泛素化修饰的哺乳类E3泛素—蛋白连接酶（pVHL和BRCA1）被报道,而且生化机制也还不很清楚。Wwp2是我们实验室在研究胚胎干细胞（ES）转录因子Oct-4的相互作用蛋白时发现并克隆的一个E3泛素—蛋白连接酶,由C2、WW和HECT （Homologous to E6-AP Carboxyl Terminus,HECT）结构域组成。应用Wwp2的WW和HECT结构域的GST融合蛋白与胚胎肿瘤细胞F9裂解液进行亲和层析,我们发现Wwp2可能与RNA聚合酶II的大亚基Rpb1结合。在本研究中,我们证实了Wwp2与Rpb1存在体外和体内不依赖于Rpb1磷酸化的特异性相互作用,而且这种相互作用是分别通过Wwp2的WW结构域和Rpb1的羧基端CTD（C-terminal domain）结构域介导的。Wwp2促进了Rpb1的体内、外泛素化修饰,在CTD上存在泛素化修饰的位点,而且,Wwp2依赖的CTD上的多聚泛素化链是通过一种新的生理功能未知的方式连接的。Wwp2介导的Rpb1泛素化修饰和降解不依赖于Rpb1的磷酸化。在正常情况下,Wwp2泛素化修饰并通过泛素—蛋白酶体途径（Ubiquitin Proteasome Pathway,UPP）降解Rpb1,严密调控Rpb1的蛋白质水平。Wwp2还可促进磷酸化的Rpb1的泛素化修饰和降解,这对于及时清理掉转录活跃基因上的发生错误的转录复合体,提高转录的整体效率,保证转录的正常进行有重要意义。Wwp2还参与UV照射引起的Rpb1的泛素化修饰,可能与转录耦联修复有关。我们的研究显示,Wwp2是一个新的Rpb1的E3泛素—蛋白连接酶,而且其生理功能有明显不同于两个已知的的E3泛素—蛋白连接酶之处。因此,我们关于Wwp2泛素化修饰Rpb1的生化机制的研究,有助于揭示Rpb1的泛素化修饰途径及其在生理和病理条件下的调控机制。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 前言
• 材料与方法
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 结果
• 3.1 Wwp2与Rpb1存在相互作用
• 3.1.1 Wwp2与Rpb1存在体外的直接相互作用
• 3.1.2 Wwp2与Rpb1体外相互作用的结构域
• 3.1.3 Wwp2与Rpb1存在体内的相互作用
• 3.2 Wwp2促进Rpb1的泛素化
• 3.2.1 Wwp2促进Rpb1CTD结构域的体外泛素化
• 3.2.2 Wwp2促进Rpb1的体内泛素化
• 3.2.3 受Tc调控的Wwp2RNAi F9 细胞株的建立
• 3.2.4 Wwp2介导的高度磷酸化的Rpb1的泛素化修饰
• 3.2.5 Wwp2介导的Rpb1CTD结构域多聚泛素化链的连接
• 3.2.6 Wwp2介导的Rpb1CTD结构域泛素化修饰的位点
• 3.3 细胞内Wwp2水平调节Rpb1的蛋白质水平
• 3.4 Wwp2参与UV照射引起的Rpb1的泛素化
• 讨论
• 4.1 Wwp2与Rpb1的相互作用
• 4.2 生理条件下Wwp2介导的Rpb1的泛素化及其功能
• 4.3 DNA损伤引起的Wwp2介导的Rpb1的泛素化及其功能
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 缩略词
• 在读期间发表的文章和获奖情况
• 致谢