植物铁蛋白基因表达载体的构建及对烟草和杨树的遗传转化

论文摘要

本研究利用反义RNA技术验证植物铁蛋白的基因功能。用农杆菌介导法将大豆铁蛋白基因SoyFer1 （M 64337）和烟草内源反义铁蛋白基因NtFer2 （AY 141105）的cDNA分别导入烟草，得到转基因烟草，并采集烟草种子。对T1转基因烟草的卡那霉素抗性分析表明，整合到烟草基因组的外源基因多为单拷贝基因，也有少数为多拷贝基因。对具有卡那霉素抗性的转基因植株进行PCR-Southern检测和Northern杂交分析表明，外源基因已整合到烟草基因组，并且得到了正确表达。将转基因株系移栽到铁离子不同的培养基中生长进行比较表明，转大豆铁蛋白基因株系的生长量明显高于非转基因株系和转内源反向铁蛋白基因烟草株系，而转内源反义铁蛋白基因株系的生长量则明显低于与非转基因株系和转大豆铁蛋白基因株系。转大豆铁蛋白基因株系和转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿素量、MDA含量和POD活性等生理性状也发生了明显变化。表现为转大豆铁蛋白基因株系的叶绿素量和POD活性明显高于与非转基因株系，而转内源反义铁蛋白基因株系的叶绿素量和POD活性等则明显低于与非转基因株系。运用同样的方法将大豆铁蛋白基因SoyFer1导入杨树基因组中，对转基因杨树进行了PCR、PCR-Southern检测，初步证明SoyFer1整合到杨树基因组中。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 课题背景（或引言）
• 1.2 铁在植物中的作用
• 1.2.1 铁的生理意义
• 1.2.2 缺铁对植物的影响
• 1.3 铁蛋白
• 1.3.1 铁蛋白结构
• 1.3.2 植物铁蛋白的分布
• 1.3.3 植物铁蛋白的生物学功能
• 1.3.4 植物铁蛋白基因的研究进展
• 1.4 验证基因功能的新方法--反义RNA技术
• 1.4.1 反义RNA的发现
• 1.4.2 反义RNA的作用原理
• 1.4.3 反义RNA技术的应用
• 1.5 杨树基因工程
• 1.5.1 林木基因工程模式植物--杨树
• 1.5.2 杨树基因工程研究进展
• 2 铁蛋白基因植物转化载体的构建及对烟草的遗传转化
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 植物材料
• 2.1.3 培养基
• 2.1.4 酶和试剂
• 2.1.5 PCR扩增引物序列
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 铁蛋白基因植物表达载体的构建
• 2.2.2 电击法将中间表达载体导入农杆菌EHA105
• 2.3 铁蛋白基因对烟草的遗传转化
• 2.3.1 无菌苗的获得
• 2.3.2 根癌农杆菌介导的烟草的遗传转化
• 2.4 结果与分析
• 2.4.1 目的基因的扩增及扩增产物的双酶切
• 2.4.2 PBI121的双酶切
• 2.4.3 中间表达载体pSF2，pNF2的鉴定
• 2.4.4 电击转化质粒的PCR扩增
• 2.4.5 转铁蛋白基因烟草的获得
• 3 转铁蛋白基因烟草的分子检测
• 3.1 实验材料
• 3.1.1 植物材料
• 3.1.2 主要试剂
• 3.2 实验方法
• 1）的遗传分析'>3.2.1 转基因烟草子一代（T₁）的遗传分析
• 3.2.2 转化烟草的PCR检测
• 3.2.3 探针的制备
• 3.2.4 PCR-Southern印迹杂交
• 3.2.5 Northern杂交
• 3.3 结果与分析
• 0代PCR检测'>3.3.1 烟草T₀代PCR检测
• 1代转基因烟草的遗传分析'>3.3.2 T₁代转基因烟草的遗传分析
• 1代烟草的检测'>3.3.3 T₁代烟草的检测
• 4 铁蛋白基因功能验证
• 4.1 实验材料
• 4.1.1 植物材料
• 4.1.2 培养基
• 4.1.3 主要试剂及仪器
• 4.2 实验方法
• 1）转基因烟草组培苗的高铁耐受性处理'>4.2.1 子一代（T₁）转基因烟草组培苗的高铁耐受性处理
• 4.2.2 生理指标测定方法
• 4.3 结果分析
• 4.3.1 转基因烟草耐铁能力分析
• 4.3.2 不同铁浓度下转基因烟草与对照叶绿素含量的比较
• 4.3.3 不同铁浓度下转基因烟草SOD活性的比较
• 4.3.4 不同铁浓度下转基因烟草与对照MDA含量的比较
• 4.3.5 不同铁浓度下转基因烟草与对照POD含量的比较
• 5 山新杨（P.davidiana×P.bolleana）组培体系的优化
• 5.1 实验材料
• 5.1.1 植物材料
• 5.1.2 培养基
• 5.1.3 培养条件
• 5.2 实验方法
• 5.2.1 植物材料的处理
• 5.2.2 外植体的接种
• 5.2.3 诱导及生根培养基和培养方法
• 5.3 结果与分析
• 5.3.1 不同培养基对茎段和叶片诱导的反应
• 5.3.2 不同培养基对生根的影响
• 6 大豆铁蛋白基因SoyFer1对山新杨的遗传转化和初步检测
• 6.1 实验材料
• 6.2 实验方法
• 6.2.1 SoyFer1基因植物表达载体的构建方法与烟草相同
• 6.2.2 根癌农杆菌介导的山新杨的遗传转化
• 6.2.3 转基因杨树DNA的提取、PCR、PCR-Southern方法同烟草
• 6.3 结果与分析
• 6.3.1 目的基因的扩增及扩增产物的双酶切
• 6.3.2 中间表达载体pST的鉴定
• 6.3.3 电击转化质粒的PCR扩增
• 6.3.4 转基因杨树的PCR与PCR-Southern检测
• 7 讨论
• 7.1 反义RNA方法分析铁蛋白基因功能
• 7.2 转铁蛋白基因烟草不同铁浓度下生理生化的反应
• 7.3 转铁蛋白基因烟草子一代遗传稳定性分析
• 7.4 铁蛋白基因对杨树的转化
• 8 结论
• 附录
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢