棉纤维发育相关EST-SSR的特征、功能及其定位

论文摘要

为了增加微卫星标记用于构建饱和的棉花分子遗传图谱，以及将功能基因组学用于棉纤维发育机理的解析和棉花遗传育种，本研究从大量的亚洲棉和陆地棉纤维发育相关EST中开发SSR引物，并且分析了SSR的特征、功能、海陆间的多态性以及在四倍体棉种At和Dt亚组的分布特征。从来源于亚洲棉开花后7～10天纤维cDNA文库的1187条EST，设计了763对EST-SSR引物，其中包含简单SSR 605条，复合SSR 158条。605条EST中，六核苷酸和三核苷酸比例最高，分别占到36％和31.3％，二核苷酸重复占20.4％，五核苷酸重复占7.9％，四核苷酸重复占4.6％。在包含简单SSR的605条EST的核苷酸重复基元中，二核苷酸重复中比例最高的是AT／TA，占12.6％。763对EST-SSR引物中687（90％）对可以在异源四倍体陆地棉TM-1和海岛棉海7124中得到扩增产物。其中有120对引物可以在这两个材料间产生多态带型，用于遗传作图。120对EST-SSR引物总共得到143个多态位点，通过作图软件，将其中的135个整合到了已有的包含511个SSR位点的遗传图谱中。从这些135个位点的分布情况来看，并不是随机的，因为有84个分布在染色体At亚组，51个在Dt亚组。利用构建的7235 5～25天的纤维和徐州142开花后0～5天的胚珠以及3～22天后纤维的cDNA文库，随机测序得到13505条EST，去掉冗余之后为5811条。其中966条包含一个以上微卫星（SSR）。根据EST-SSR引物设计的标准，共得到489对EST-SSR引物。在这部分EST中，三核苷酸重复最多，占59.1％；然后是二核苷酸重复，占30％；四核苷酸重复占6.4％；六核苷酸重复占2.7％；最少的是五核苷酸重复，占1.8％。在所有的重复基元中，AT／TA占的比例最高，约为18.4％，其余的依次为CTT／GAA（5.3％），AG／TC（5.1％），AGA／TCT（4.9％），AGT／TCA（4.5％），AAG／TTC（4.5％）等。489对引物在作图亲本TM-1和海7124间存在多态的共114对，产生130个多态位点。其中129个位点整合到现有的遗传图谱上，有66个分布在染色体At亚组，63个在Dt亚组。在从Genbank dbEST数据库下载来源于陆地棉遗传标准系TM-1的-3～3dpa胚珠的32190条EST中，去冗余之后为12463条，利用SSRIT和Primer3设计得到454对EST-SSR引物。这些EST重复基元中，六核苷酸重复和三核苷酸重复最多，分别占47.3％和38.8％，二、四、五核苷酸重复分别占7.5％、3.2％、3.2％。所有的核苷酸重复基元中，三核苷酸AGA／TCT所占比例最高，约占4.3％；二核苷酸重复中，比例最高的是AG／TC，占2.6％：四核苷酸重复中，AAAC／TTTG比例最多，占约1.5％；五核苷酸和六核苷酸重复中，CCCAA和CCACCT／GGTGGA所占比例最高，分别是0.4％和1.1％。454对引物扩增海陆BC1作图群体亲本TM-1和海7124，总共84对产生多态条带，可以进行定位研究。84对引物扩增共存在90个多态位点。其中84个位点（包括8个偏分离位点）能够整合到该作图群体的遗传框架图上。84个位点分布在26条染色体上，有40个分布在染色体At亚组，44个分布在染色体Dt亚组。616对MUSS／MUCS EST-SSR引物扩增共有22对产生多态条带。产生23个多态位点。其中有22个位点（包括3个偏分离位点）可以整合遗传框架图上。四倍体棉花基因组的At和Dt亚组各分布11个多态位点。从亚洲棉和陆地棉的87154条EST序列中，利用blastclust软件得到非冗余序列39507条，总长度为28005.9kb，其中二～六核苷酸重复大于等于18bp的SSR共有2146个，平均每13.05kb出现一个SSR。所有的重复类型中，六核苷酸重复最多，占36.8％；AT／TA比例最高，占7.4％。在本研究得到的386个标记位点中，有24对EST-SSR引物扩增得到的重复位点分布在相应的部分同源染色体上。有16对EST-SSR引物产生的重复位点分布在非部分同源染色体或同一染色体。整合后的图谱包含1052个位点，图距总计6321cM，平均两个位点间的距离为6.0cM。其中A3、A11、D1和D11染色体各包括两个连锁群。每条染色体上的标记数目从22-58不等，图距从144.5-383.5 cM。整合到遗传图谱上的43个偏分离EST-SSR标记中，偏向亲本TM-1的有22个，偏向海7124的有21个。利用Blast2go软件，将已知功能的EST按照细胞组分、分子功能和生物进程分为三大类。在细胞组分一类中，大多数被归为细胞（cell，41％）和细胞器（organelle，36％）两类；分子功能的分类中，催化活性（catalytic activity）和结合（binding）各约占22％和24％；在第三分类生物进程中，大部分归为生理进程（physiological process，38％）或细胞进程（cellular process，36％）。本研究将部分糖代谢相关基因、转录因子和信号转导类基因定位到染色体，如蔗糖合酶定位到了A6染色体上，E6定位到A5和D5染色体，MYB60定位到A13染色体等。另外，A8染色体上定位了一个耐盐蛋白基因NAU920。针对棉花遗传图谱的研究已经开发了多种分子标记，但是根据棉花已克隆的基因开发的SNP标记相对较少。利用PCR技术扩增出陆地棉TM-1和海岛棉海7124中基因FbL2A的序列，分析了材料间存在的单核苷酸多态性（SNPs）。根据TM-1和海7124两个材料中FbL2A基因的测序结果，采用NEBcutter软件分析，选择BstUI内切酶酶解扩增产物，利用Mapmaker v3.0作图软件将FbL2A基因定位到D2染色体。FIF1基因是棉纤维优势表达的一个基因，研究证明它可能在棉纤维的发育过程中起着很重要的调控作用。根据已发表的亚洲棉FIF1基因，设计特异引物，克隆了陆地棉TM-1和海岛棉海7124中FIF1基因。根据两个四倍体棉花FIF1基因的SNP变异，采用SNAP和CAPs方法将该基因定位到A8染色体。研究表明棉花SNP标记的开发是可行的，也是有效的。EST-SSR和SNP标记的开发将能够更方便的将EST或基因应用到棉花的图谱构建，QTLs定位及克隆，以及棉花二倍体和四倍体的进化与比较基因组研究。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 本文所用主要缩略词
• 第一部分 文献综述
• 第一章 棉纤维发育相关基因和EST研究进展
• 1 已克隆的棉纤维发育相关基因
• 2 棉纤维发育EST研究
• 2.1 EST的基本概念
• 2.2 EST的获取
• 2.3 EST的应用
• 2.3.1 鉴定新基因
• 2.3.2 制备基因芯片
• 2.3.3 用于分子标记开发
• 2.4 棉纤维发育相关EST研究进展
• 第二章 棉花分子遗传图谱研究进展
• 1 分子遗传图谱应用的分子标记
• 2 SSR
• 3 EST-SSR
• 3.1 EST中SSR的检测
• 3.1.1 非冗余EST的获得
• 3.1.2 SSR-EST的获得
• 3.1.3 EST-SSR引物设计
• 3.1.4 EST-SSR标记的开发与应用
• 4 SNP
• 4.1 基于SNP的SNAP标记
• 4.2 基于SNP的RFLP和CAPs标记
• 5 遗传连锁图谱的作图群体
• 2代或由其衍生的F_2:3家系'>5.1 单交组合所产生的F₂代或由其衍生的F_2:3家系
• 5.2 重组近交系（Recombinant Inbred Line,RIL）
• 5.3 加倍单倍体（Doubled Haploids,DH）群体
• 5.4 回交群体
• 6 遗传图谱的构建
• 7 棉花分子遗传图谱研究进展
• 8 棉花分子遗传图谱研究存在的问题
• 本研究的目的与意义
• 第二部分 研究报告
• 第三章 棉花EST-SSR的开发及定位
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 EST来源
• 1.3 EST中SSR的搜索
• 1.4 EST-SSR引物开发
• 1.5 EST-SSR标记的命名
• 1.6 DNA的提取
• 1.7 SSR扩增和电泳
• 1.7.1 SSR反应体系
• 1.7.2 SSR PCR程序
• 1.7.3 SSR PCR扩增产物的PAGE/银染检测
• 1.8 DNA片段的回收、连接、转化、测序和序列分析
• 1.9 遗传作图
• 1.10 功能分析
• 2 结果与分析
• 2.1 EST-SSR的特征
• 2.1.1 亚洲棉EST-SSR的特征
• 2.1.2 陆地棉EST-SSR的特征
• 2.1.2.1 来源于陆地棉7235和徐州142 EST-SSR的特征
• 2.1.2.2 来源于陆地棉TM-1 EST-SSR的特征
• 2.1.3 亚洲棉和陆地棉大于18bp的EST-SSR特征分析
• 2.2 EST-SSR引物的开发
• 2.3 EST-SSR测序鉴定
• 2.4 EST-SSR遗传图谱的构建
• 2.4.1 锚定标记的选择与连锁群的构建
• 2.4.2 EST-SSR图谱的主要特征
• 2.4.3 重复位点在染色体上的分布特征
• 2.4.4 四倍体棉种遗传图谱的总特征
• 2.5 EST-SSR功能分析
• 2.5.1 EST-SSR功能分类
• 2.5.2 多态EST-SSR的功能分析
• 2.5.2.1 定位的功能基因
• 2.5.2.2 功能基因在染色体上的分布
• 3 讨论
• 3.1 EST-SSR是具有功能的标记
• 3.2 SSR设定的标准
• 3.3 EST-SSR引物的多态率
• 3.4 EST-SSR位点分布
• 3.5 四倍体棉花遗传图谱的长度的估计
• 3.6 EST-SSR在棉花基因组研究中的应用
• 第四章 2个棉纤维发育相关基因的SNPs研究及定位
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计
• 1.2.2 DNA提取、PCR扩增、回收、克隆、测序及分析
• 1.2.3 CAPs标记开发
• 1.2.4 SNAP标记开发
• 2 结果和分析
• 2.1 四倍体棉种中FbL2A和FIF1的克隆和SNP分析
• 2.1.1 四倍体棉种中FbL2A的克隆和SNP分析
• 2.1.2 四倍体棉种中FIF1的克隆和SNP分析
• 2.2 基于SNP的标记开发
• 2.2.1 CAPs标记
• 2.2.2 SNAP标记
• 2.3 基因的染色体定位
• 3 讨论
• 3.1 四倍体棉花基因的克隆
• 3.2 棉花的SNPs标记及其基因定位
• 全文结论
• 参考文献
• 附表1
• 附表2
• 附表3
• 发表论文及参与课题
• 致谢