抗MATSA单克隆抗体的制备与鉴定

论文摘要

马立克氏病（Marek’s disease,MD）肿瘤相关表面抗原（Marek’s diseasetumor-associated surface antigen,MATSA）是MD肿瘤细胞和MD成淋巴系细胞表面存在的特异性抗原,可刺激机体产生对MD免疫非常重要的抗肿瘤免疫应答,并可用于MD的鉴别诊断。本研究用纯化的MATSA免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞株,并对阳性杂交瘤细胞染色体进行分析。将阳性杂交瘤细胞株接种Balb/c小鼠制备单克隆抗体（McAb）腹水,硫酸铵盐析法粗提McAb并鉴定亚类。通过制备MATSA的McAb,为进一步研究MD肿瘤提供试验材料和理论依据。研究取得如下结果。1.以纯化的MATSA为抗原免疫5只Balb/c小鼠,共免疫6次,间接ELISA测定小鼠血清中MATSA抗体。结果表明,第3次免疫后,测得各小鼠血清中抗体效价分别为26、26、24、26、26;第4次免疫后,抗体效价分别为26、26、26、26、27;第5次免疫后,抗体效价分别为28、28、28、28、28;第6次免疫后,抗体效价分别为213、213、213、213、213,抗体效价明显升高,可以用于制备MATSA的McAb。2.先后取免疫好的2只小鼠脾细胞,进行了2次细胞融合,第一次用3号小鼠,融合后未出现杂交瘤细胞,第二次用1号小鼠,融合后铺4块板,共384个孔,其中116个孔有融合细胞,融合率为30.2%。经间接EL ISA法筛选,抗体阳性孔为22个,阳性率为19%。从阳性孔中选阳性OD值高、生长状态好的孔,用有限稀释法经过3次克隆,筛选到3株能稳定分泌抗MATSA单克隆体的细胞株。杂交瘤细胞传代培养、液氮冻存及复苏后仍能稳定地分泌抗体,ELISA检测阳性细胞培养上清效价达26。3.对筛选出的3株杂交瘤细胞用秋水仙素阻断法进行核型分析,杂交瘤细胞染色体数目为52±2对,接近两种亲本细胞染色体数目总和,证明为两种亲本细胞融合后的杂交体。4.将杂交瘤细胞株细胞腹腔注射100只Balb/c小鼠,收集腹水,腹水中MATSA抗体效价为210。共收集336 mL腹水,经饱和硫酸氨粗提,真空冷冻干燥,获得抗MATSA粗提抗体16.80 g。经MSB1间接免疫荧光染色实验表明,制备的单抗与MSB1细胞有阳性反应。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 文献综述
• 第一章 人源化抗体制备及其应用研究进展
• 1.1 人源化抗体的构建
• 1.1.1 嵌合抗体
• 1.1.2 CDR移植的人源化抗体
• 1.1.3 完全人源化抗体
• 1.2 人源化抗体的表达
• 1.2.1 大肠杆菌
• 1.2.2 酵母
• 1.2.3 昆虫
• 1.2.4 哺乳动物
• 1.3 人源化抗体的临床应用
• 1.3.1 肿瘤治疗
• 1.3.2 自身免疫性疾病的治疗
• 1.3.3 器官移植急性排斥反应的预防与治疗
• 1.4 展望
• 第二章 马立克氏病肿瘤相关表面抗原的研究进展
• 2.1 MATSA的分布与表达
• 2.2 MATSA的分离和纯化
• 2.3 MATSA的理化特性
• 2.4 MATSA抗体
• 2.5 展望
• 试验研究
• 第三章 MATSA免疫小鼠试验
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验动物
• 3.1.2 主要试剂
• 3.1.3 试验仪器
• 3.2 试验方法
• 3.2.1 小鼠免疫
• 3.2.2 小鼠血清的制备
• 3.2.3 小鼠血清抗体的检测
• 3.3 结果
• 3.4 讨论
• 3.4.1 关于MATSA及其对小鼠的免疫原性
• 3.4.2 抗体检测方法
• 3.5 小结
• 第四章 抗MATSA单克隆抗体的制备及鉴定
• 4.1 试验材料
• 4.1.1 试验动物
• 4.1.2 细胞系
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 验方法
• 4.2.1 细胞融合及建株
• 4.2.2 单克隆抗体的鉴定
• 4.3 结果
• 4.3.1 动物免疫
• 4.3.2 细胞融合与细胞克隆
• 4.3.3 杂交瘤细胞株的建立
• 4.3.4 抗体效价检测结果
• 4.3.5 杂交瘤细胞染色体分析
• 4.3.6 单克隆抗体相对亲和力测定
• 4.3.7 McAb亚类鉴定
• 4.3.8 抗体的制备
• 4.3.9 MSB1间接免疫荧光染色实验
• 4.4 讨论
• 4.4.1 动物免疫
• 4.4.2 细胞融合
• 4.5 小结
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 作者简介