转基因杨的检测、整合机制与抗虫性研究

论文摘要

以转基因小黑杨的DNA为模板,进行扩增T-DNA的侧翼片断。结果表明在含有多拷贝外源基因的转基因小黑杨中,第一种情况是两相邻T-DNA存在头对尾方式的整合模式,整合后左右边界均有不同程度的缺失。右边界断裂位点是G,缺失23bp（ACAGGATATATTGGCGGGTAAAC）;左边界缺失13bp（TGGCAGGATATAT）,断裂位点是T。第二种为相邻两T-DNA之间有序列插入的头对尾整合方式,插入的片段为T-DNA上的外源基因Cry1A（b）的部分片段,长为334bp。T-DNA右边界缺失了19bp（GATATATTGGCGGGTAAAC）,左边界缺失7bp（TGGCAGG）。T-DNA左、右边界整合处杨树DNA序列富含A+T,分别为62.07%和72.11%。右边界缺失22bp（CAGGATATATTGGCGGGTAAAC）,左边界缺失13bp（TGGCAGGATATAT）。本文研究了一种检测转基因杨树的通用方法,以及转基因小黑杨中外源基因的整合方式。根据T-DNA上nos终止子的序列设计引物,开发出一种检测转基因杨树的semi-nested PCR方法,具有快速、简便和可靠等特点。根据T-DNA序列和克隆T-DNA旁侧植物DNA序列来设计引物,通过PCR扩增即可区分不同的转基因株系。本文初步研究了转基因单倍体小黑杨对天幕毛虫幼虫的抗性,表明该转基因小黑杨可延缓天幕毛虫幼虫发育,与对照相比转基因株系TT1和TT3分别使1～3龄的幼虫发育延缓1.24d和2.92d;取食TT1 8～19d的幼虫平均体重与对照相比分别下降1.42%～17.37%、取食TT3 8～19d幼虫平均体重分别下降了10.77%～24.80%;取食TT14～18d幼虫的校正死亡率分别为9.52%～49.32%、取食TT3 4～18d幼虫的校正死亡率分别为11.11%～52.70%。取食转基因植株TT1幼虫的蜕皮指数2.969～3.769、毒力为0.010～0.026,取食转基因植株TT3幼虫的蜕皮指数2.906～3.714、毒力为0.032～0.041。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 绪论
• 1.1 杨树抗虫基因工程及其抗虫性
• 1.2 转基因植物检测技术
• 1.2.1 PCR技术在转基因植物检测中应用
• 1.2.2 转基因植物的Southern印迹杂交
• 1.2.3 转基因植物的Northern印迹杂交
• 1.2.4 转基因植株检测基因芯片技术
• 1.2.5 转基因植物组织化学染色检测
• 1.2.6 转基因植物原位杂交检测
• 1.2.7 转基因植物免疫测定法
• 1.2.8 转基因植物的电化学发光检测
• 1.3 外源基因与植物基因组的整合
• 1.3.1 农杆菌介导的植物基因转化原理
• 1.3.2 外源基因在植物体内的整合
• 1.4 转基因植株中外源基因的整合方式分析的常用方法
• 1.5 本项目研究目的及意义
• 2 T-DNA在转基因杨中的整合
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 主要的仪器设备
• 2.1.3 培养细菌用的LB培养基
• 2.1.4 常用溶液的配置
• 2.1.5 酶及其它生化制剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 转基因杨树叶中提取DNA
• 2.2.2 T-DNA旁侧植物DNA片段的扩增
• 2.2.3 感受态细胞制备
• 2.2.4 产物回收
• 2.2.5 T载体的连接及转化
• 2.2.6 筛选（PCR检测两步）
• 2.2.7 测序
• 2.3 结果
• 2.3.1 转基因杨树叶中提取DNA电泳图
• 2.3.2 基因组的酶切
• 2.3.3 多拷贝T-DNA间的整合方式
• 2.3.4 T-DNA侧翼片段的扩增
• 2.4 本章小结
• 3 转基因抗虫杨的PCR检测
• 3.1 材料和方法
• 3.1.1 通用转基因植物PCR检测方法
• 3.1.2 转基因抗虫杨不同株系特异性检测
• 3.2 结果
• 3.2.1 转基因杨树的semi-nested PCR检测
• 3.2.2 转基因抗虫杨不同株系特异性检测
• 3.3 本章小结
• 4 转基因抗虫杨的抗虫性
• 4.1 研究材料与方法
• 4.1.1 材料
• 4.1.2 方法
• 4.2 研究结果
• 4.2.1 转基因植株对天幕毛虫幼虫各龄历期和发育速率的影响
• 4.2.2 转基因植株对天幕毛虫幼虫体重的影响
• 4.2.3 转基因植株对天幕毛虫幼虫死亡率的影响
• 4.2.4 转基因植株对天幕毛虫幼虫蜕皮指数影响和毒力表现
• 4.2.5 天幕毛虫幼虫取食行为和死亡症状
• 4.3 本章小结
• 结论
• 参考文献
• 攻读学位期间发表的学术论文
• 致谢