论文摘要
研究背景树突状细胞（dendritic cell，DC）是目前所知的机体内功能最强的专职性抗原提呈细胞，是机体细胞免疫反应的始动者，在肿瘤免疫应答的诱导中具有独特的地位。而在体内，肿瘤组织通过分泌抑制性细胞因子营造特殊的微环境来影响树突状细胞的功能，从而逃脱机体的免疫监视。探讨肿瘤环境下树突状细胞的功能及作用将是一个新的研究热点。最近George Coukos等研究发现，肿瘤浸润树突状细胞前体在VEGF-A的影响下，发生内皮细胞化，参与了肿瘤微血管的形成，从而促进了肿瘤的生长、扩散、转移。研究目的本实验研究直肠癌肿瘤微环境对DC的功能和细胞表型的影响，在体外利用直肠癌匀浆上清液作为人外周血来源的DC培养的诱导分化剂，来观察DC内皮化等表型变化的现象，探讨肿瘤血管发生的新机制，为肿瘤治疗提供一种新的治疗靶点和治疗思路。实验方法1．免疫组化检测肿瘤微血管处S-100蛋白的表达免疫组化SABC法对10例直肠癌及癌旁组织切片进行检测，来观察肿瘤组织微血管壁及微血管旁有无S-100蛋白的表达，因S-100蛋白可作为树突状细胞的一种特异性标记分子，可以间接推测肿瘤环境中DCs是否参与了肿瘤微血管的形成。2．ELISA检测匀浆上清液VEGF-A的含量将肿瘤组织200mg：1ml生理盐水的比例制成肿瘤组织匀浆，用ELISA方法检测癌及癌旁匀浆上清中VEGF-A活性因子含量的差异。3．直肠癌匀浆上清对树突状细胞表型的影响从外周血来源的单核细胞来培养树突状细胞，在DC发育的早期加入匀浆上清诱导其内皮化。树突状细胞在培养至第7d前，可视为未成熟状态。因此设第3d癌上清加入组，第3d癌旁上清加入组；第7d癌上清加入组，第7d癌旁上清加入组；并设未加上清的正常培养组作对照。4．流式细胞学检测培养细胞CD1a/CD31,CD1a/CD34双阳性的表达FACS Calibar检测，Cellquest分析软件分析检测结果。5．免疫细胞化学检测培养细胞vWF的表达对培养细胞进行单细胞悬液涂片，观察内皮性标记分子vWF的表达情况。6．统计分析采用SPSS10.0统计软件包进行统计学分析，计量资料用（?）±s表示；两组之间比较采用t检验；两组以上均数的比较采用单因素方差分析（ANVOA）；以α=0.05为检验水准。实验结果1、S-100蛋白的表达肿瘤微血管旁和血管壁可发现S-100蛋白的表达，但数量较少，未进行统计学处理。2、ELISA检测匀浆上清VEGF-A含量癌及癌旁匀浆上清液里活性因子测定显示，与癌旁匀浆上清相比，癌上清里活性因子VEGF-A的浓度明显高于对照组，两组之间的差异具有显著性（P＜0.05）。3、CD31，CD34、CD1a等标记分子的动态表达情况未加入肿瘤匀浆上清液的正常培养的树突状细胞，动态观察第1d、3d、7d、10d、14d时CD31，CD34，CD1a等标记分子的表达水平，结果显示：CD31和CD34随培养时间延长表达逐渐下降，CD1a在1-7d过程中表达逐渐升高，7-14d过程中表达则变化不大。4、匀浆上清对DC内皮化的诱导效应第3d加入各组间比较显示：癌上清及癌旁上清组CD1a/CD31、CD1a/CD34双阳性的表达率均高于正常对照组，且差异具有显著性（p＜0.05）；第7d加入各组间比较显示：癌上清及癌旁上清组的CD1a/CD31、CD1a/CD34双阳性的表达率也高于正常对照组，且差异具有显著性（p＜0.05）；第3d加入各组CD1a/CD31，CD1a/CD34双阳性表达率均高于其相对应的第7d加入的各组，且差异具有显著性（p＜0.05）。癌上清组CD1a/CD31，CD1a/CD34双阳性表达率略高于癌旁上清组相比，但差异不显著（p＞0.05）。5、培养细胞vWF的表达癌上清组和癌旁上清组培养细胞开始表达vWF内皮性标记分子，与正常组相比，差异具有显著性（p＜0.05），癌与癌旁上清组相比，差异不显著（p＞0.05）。实验结论1、在直肠癌肿瘤微血管壁及血管旁均发现DC的出现，说明肿瘤组织浸润的未成熟状态的树突状细胞一部分趋化到肿瘤微血管处。2、癌匀浆上清中活性因子VEGF-A的浓度明显高于癌旁上清。3、癌及癌旁匀浆上清可以促使末成熟状态的DC高表达双阳性CD1a/CD31、CD1a/CD34和Vwf内皮性标记分子，使其趋向内皮化。