拟南芥与核盘菌互作及与核盘菌、水稻白叶枯病菌相关的拟南芥突变体筛选

论文摘要

油菜菌核病是我国和世界油菜主产区的一种重要真菌病害,它是由核盘菌侵染造成的。该病严重年份病株率可达50-80%,但是当前生产上主栽的油菜品种抗性普遍较差。由于对油菜和菌核病菌互作机理缺乏了解,油菜抗菌核病研究进展缓慢。 本博士论文选用与油菜同为十字花科的模式植物拟南芥作为材料,通过建立核盘菌在拟南芥上侵染体系,研究拟南芥和核盘菌互作的生理生化和分子机制。通过遗传转化拟南芥,检测木霉几丁质酶在防治核盘菌侵染上的效果。以上研究将为进一步防治广谱的植物病原菌核盘菌提供技术途径及抗性材料。 白叶枯病是水稻上的重要病害。水稻白叶枯菌不能侵染双子叶的拟南芥,因此拟南芥中存在非寄主抗性,通过功能的缺失,筛选白叶枯菌敏感的突变体,对研究拟南芥中对水稻白叶枯菌非寄主抗性有重要的意义。 主要研究结果如下: 1 建立了新的核盘菌对拟南芥的侵染体系 观察了核盘菌在小麦培养基、小米培养基和稻壳培养基等3种培养基上的生长情况。结果表明培养7d后小米粒上均匀覆盖白色菌丝体,并且很少出现黑色菌核,通过在三种不同生态型拟南芥上接种试验,均表现为感病。建立了核盘菌在拟南芥上的侵染体系:核盘菌在PSA上,25℃、黑暗培养48—72h活化,然后将活化的菌丝小块接种到小米培养基中,培养7d（每天摇动1次）后,将小米粒均匀接种到40d左右的拟南芥种植基质表层。饱和湿度下生长24h、正常条件下生长48h后,病菌可以侵染并致死拟南芥植株。 2 核盘菌侵染拟南芥的细胞学特征及致病机理 通过侵染初期的细胞学观察,发现病菌主要以菌丝形态在拟南芥叶片表面伸展蔓延,同时在少量的菌丝顶端或者侧面形成一些球状或者垫状的结构,其功能有待进一步研究。接种后24h出现黄褐色湿腐症状,72h后植株全部软腐而死。通过对核盘菌外泌的水解酶的测定,纤维素酶是该菌分泌的最主要的一种酶,合适的酸性pH有利于病菌分泌纤维素酶。草酸作为该菌的另一个致病因子,主要通过酸性的氢离子快速诱导叶片坏死斑,其诱导的机制可能与其它的无机酸有所不同。 3 明确了核盘菌侵染后拟南芥的防卫机制 核盘菌侵染拟南芥后24h,植株诱导产生了致病相关蛋白几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶。病菌侵染8h后,开始诱导防卫基因PDF1.2的表达,12h后PDF1.2表达量增加10倍左右,24h后表达量提高20倍左右,但是却不能诱导PR1基因的表达,表明核盘菌侵染可能激发茉莉酸/乙烯依赖的防卫反应途径,这与该菌腐

论文目录

• 致谢
• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一部分 文献综述
• 第一章 核盘菌的病原学特性及作物抗菌核病育种研究进展
• 1 农业生产上的重要性
• 2 核盘菌的病原学特性
• 3 抗病育种与病害防治现状
• 3.1 抗病育种
• 3.2 病害防治现状
• 第二章 植物病原真菌致病机理
• 1 病原真菌致病毒素
• 2 致病相关的酶系
• 3 核盘菌致病机理的研究现状
• 第三章 植物病原菌与拟南芥的互作
• 1 拟南芥作为模式植物的优点
• 2 植物病原菌与拟南芥互作的研究现状
• 2.1 植物病原细菌与拟南芥互作的研究现状
• 2.2 植物病毒与拟南芥互作的研究现状
• 2.3 植物病原真菌与拟南芥互作的研究现状
• 2.3.1 活体寄生菌（Biotroph）
• 2.3.2 死体寄生菌（Necrotroph）
• 3 寄主抗性与非寄主抗性
• 3.1 非寄主抗性
• 3.2 寄主抗性
• 4 病原菌植物信号传导网络
• 4.1 基因对基因的学说
• 4.2 激发子和无毒基因
• 4.3 抗性基因和植物防卫物质
• 4.4 植物防卫反应的途径
• 4.5 防卫反应信号网络
• 第四章 木霉菌胞壁降解酶基因及抗病基因工程
• 1 木霉产生的胞壁降解酶种类和特征
• 2 木霉菌胞壁降解酶基因
• 2.1 种类
• 2.2 特征
• 3 木霉菌胞壁降解酶基因在植病生防上的应用
• 3.1 利用木霉胞壁降解酶基因提高植物的抗病性
• 3.2 不同木霉几丁质酶基因对植物生长的影响
• 第五章 拟南芥突变库的构建及与核盘菌、黄单胞菌相关的功能基因研究
• 1. 拟南芥突变体库的构建方法
• 1.1 物理诱变突变体库的构建及其利用
• 1.2 化学诱变突变体库的构建及其利用
• 1.3 T-DNA插入突变体库的构建及其利用
• 2. 核盘菌相关的拟南芥功能基因研究
• 3. 黄单胞菌相关的拟南芥功能基因研究
• 第六章 研究目的和内容
• 1. 研究目的
• 2. 研究内容
• 第二部分 研究报告
• 第七章 核盘菌侵染拟南芥体系的建立
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 病原菌菌株
• 1.1.2 植物材料
• 1.1.3 使用肥料
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 麦粒培养基的制备
• 1.2.2 小米培养基的制备
• 1.2.3 稻壳培养基的制备
• 1.2.4 病原菌的培养和接种体的制备
• 1.2.5 拟南芥的生长
• 1.2.6 病原菌的接种和拟南芥感病性的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 接种体制备方法的比较
• 2.2 核盘菌在拟南芥上的侵染观察
• 3 讨论
• 第八章 核盘菌侵染拟南芥细胞学观察和致病机理分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 病原菌菌株
• 1.1.3 试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.1.5 酶活性测定的底物
• 1.2 方法
• 1.2.1 拟南芥叶片接种
• 1.2.2 拟南芥叶片上病菌菌丝的Trypan blue染色
• 1.2.3 病菌液体培养
• 1.2.4 病菌分泌的水解酶活性测定
• 1.2.5 pH对核盘菌分泌水解酶的影响
• 1.2.6 草酸及其它无机酸对拟南芥叶片的死亡斑诱导
• 2 结果与分析
• 2.1 核盘菌在拟南芥叶片上侵染过程观察
• 2.2 核盘菌人工培养过程中分泌水解酶的测定
• 2.3 培养基的pH值对核盘菌产生水解酶能力的影响
• 2.4 草酸及无机酸对拟南芥叶片的诱导死亡
• 3 讨论
• 第九章 核盘菌侵染后拟南芥的防卫反应
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 病原菌菌株
• 1.1.3 常用试剂
• 1.1.4 培养基
• 1.2 方法
• 1.2.1 核盘菌接种
• 1.2.2 酶的提取
• 1.2.3 酶活性的测定
• 1.2.4 RNA的提取
• 1.2.5 RNA杂交
• 2 结果与分析
• 2.1 病菌侵染后叶片中酶活性的变化
• 2.2 病菌侵染后防卫基因的激活
• 3 讨论
• 第十章 木霉菌对油菜菌核病菌的寄生作用及转木霉胞璧降解酶基因ThEn4对拟南芥的遗传转化
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 受体拟南芥
• 1.1.2 转化菌株、病菌菌株和生防菌株
• 1.1.3 目的基因和植物表达载体
• 1.1.4 目的基因ThEn42检测的特异性引物
• 1.1.5 培养基与缓冲液
• 1.2 方法
• 1.2.1 木霉菌对核盘菌拮抗作用的观察
• 1.2.2 拟南芥基因组 DNA的提取
• 1.2.3 质粒 DNA的农杆菌转化
• 1.2.4 根癌农杆菌介导的拟南芥遗传转化
• 1.2.5 转化植株种子的抗生素筛选
• 1.2.6 转化植株的PCR鉴定
• 1.2.7 转基因植物的southern杂交
• 1.2.8 转基因植物的northern杂交
• 1.2.9 转基因植株的抗病性测定
• 2 结果与分析
• 2.1 哈茨木霉对油菜菌核病菌寄生作用
• 2.2 农杆菌转化
• 2.3 农杆菌介导转化拟南芥后 T1代种子的潮霉素检测
• 2.4 转基因植株分子检测和表型观察
• 2.5 转基因拟南芥对油菜菌核病菌的抗性
• 3 讨论
• 第十一章 与核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）和水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）相关拟南芥突变体的筛选
• 1. 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 菌株和质粒
• 1.3 实验试剂与营养液
• 1.4 拟南芥的种植
• 1.5 农杆菌的制备
• 1.6 拟南芥的转化
• 1.7 拟南芥 T1代转化植株的筛选
• 1.8 EMS处理拟南芥种子后 M2代种子的制备
• 1.9 抗核盘菌和感水稻白叶枯菌拟南芥突变体筛选
• 1.10 水稻白叶枯病菌敏感拟南芥突变体验证
• 2. 结果与分析
• 2.1 激活标签以及 EMS处理拟南芥种子的抗核盘菌突变体筛选
• 2.2 EMS处理拟南芥的种子对水稻白叶枯菌敏感的突变体筛选
• 2.3 可能水稻白叶枯病菌敏感拟南芥突变体验证
• 3. 讨论
• 第十二章 全文小结
• 参考文献
• 附录1 主要试剂和仪器
• 附录2 常用培养基、缓冲液配方
• 附录3 本文所用缩略词-中英文对照
• 附录4 发表、录用论文及主持项目