Rapamycin与As2O3联合诱导NB4细胞凋亡及其信号转导机制的研究

论文摘要

背景与目的:As2O3在临床上用于治疗APL,尤其是对维甲酸耐药及难治的APL 已经取得了显著的疗效。As2O3 抗肿瘤作用机制包括以下几个方面:（1）降解PML-RARα蛋白;（2）调节凋亡相关基因的表达;（3）通过线粒体依赖性通路诱导细胞凋亡;（4）诱导肿瘤细胞分化;（5）通过原浆毒及过氧化自由基发挥抗肿瘤作用;（6）直接损伤DNA;（7）抑制血管生成;（8）下调端粒酶的活性。As2O3对APL 主要作用机制是诱导APL 细胞分化和凋亡,以及影响细胞周期的调控和相关的信号转导通路。Rapamycin 是大环内酯类抗生素,具有抗真菌、免疫抑制及抗肿瘤的作用,它通过与细胞内特异性亲和蛋白FKBP-12 结合形成RAP-FKBP-12 复合物并与其靶蛋白mTOR 的FRB 域结合,抑制mTOR的蛋白激酶催化活性,使之对下游效应分子p70S6K、4EBP1/eIF4E 等磷酸化的调节作用减弱或消失,阻断氨基酸等营养因子和多种生长因子转导的信号下传作用,从而抑制了翻译的开始;Rapamycin 还能通过降低CDK-cyclin 复合物激酶的活性,使细胞周期阻滞在G1期,从而发挥抗肿瘤的作用。近年来,肿瘤被认为是一种“细胞周期性疾病”,所以细胞周期可以作为抗癌药物的靶点,单一靶点药物单独应用诱导肿瘤凋亡的作用较弱,而联合应用多靶点药物的效果可能明显优于单一药物治疗且毒性反应可能减轻。根据作用于细胞周期的不同靶点或时相,本实验选用As2O3和Rapamycin 在体外联合作用于APL 的细胞株NB4 细胞,以期它们对NB4 细胞的凋亡有协同作用。本实验的目的在于,通过观察As2O3和Rapamycin 对NB4 细胞的凋亡、细胞周期及相关蛋白的表达等方面的影响,探讨As2O3 和Rapamycin 的联合应用对NB4 细胞凋亡的协同作用及其相关信号转导机制,为临床更有效治疗APL 提供实验依据。方法: 用不同浓度（0.54.0μmol/L） 的As2O3 （ 或） 与Rapamycin（20nmol/L）联合处理NB4 细胞16h 或20h 后,台盼蓝拒染法测细胞增殖能力;姬姆萨染色观察凋亡细胞的形态学变化;采用流式细胞技术分析细胞周期和细胞凋亡情况;采用琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡的DNA Ladder（DNA 梯形条带）;Western blot 法检测凋亡相关蛋白caspase-3、ERK1/2信号通路相关蛋白p44/42 MAPK和p90RSK、mTOR 下游信号途径蛋白4EBP1/eIF4E 和p70S6K以及细胞周期相关蛋白p34cdc2 和cyclinB1 的表达及修饰的变化。结果:台盼蓝拒染法证实As2O3处理NB4 细胞16h 后,细胞总数和活细胞数均不同程度减少,细胞增殖能力减低。姬姆萨染色后,在光学显微镜下可观察到NB4 细胞的形态学变化:细胞体积变小,细胞膜完整,细胞核固缩呈不规则形或圆形,染色质致密成团块状和典型的凋亡小体。流式细胞术结果显示As2O3处理NB4 细胞后,G2/M 期细胞增加,而且随着As2O3浓度的升高,作用时间的延长,G2/M 期细胞增多越显著（P<0.01）。DNA 含量分析表明,0.5μmol/L As2O3处理NB4细胞16h,G1期前开始出现亚二倍体凋亡峰（AP）。琼脂糖凝胶电泳显示,0.54.0μmol/L As2O3处理NB4 细胞16h 后,基因组DNA 呈现凋亡细胞典型的梯状图谱。与As2O3 组比较,Rapamycin+As2O3 组阻滞在G1 期的细胞增多（P<0.05）,细胞凋亡率增加（P<0.05）且随着作用时间的延长,G1 期细胞增多和细胞凋亡率增加;DNA 片段凝胶电泳可看到基因组DNA 呈现明显的凋亡梯形条带,而且DNA 凋亡所断裂的条带更多,更清晰。Western blot 结果显示: （1） 与对照组比较, As2O3 组和

论文目录

• 一、论文
• （一） 中文摘要
• （二） 英文摘要
• （三） 前言
• （四） 材料
• （五） 方法
• （五） 结果
• （六） 讨论
• （七） 结论
• （八） 参考文献
• 二、文献综述
• （一） 正文
• （二） 参考文献
• 三、致谢
• 四、缩略词表