丙酮酸调控小鼠卵母细胞排卵后老化的研究

论文摘要

卵母细胞排卵后老化显著影响其胚胎发育。排卵后老化的卵母细胞受精后出生的小鼠表现出神经敏感和情绪的异常。与输卵管内滞留一样,体外培养成熟卵母细胞也会导致卵母细胞老化。然而,人类和一些动物通常可以在发情周期的任何一天从事性行为,这可能导致排卵后老化的卵母细胞受精。另外,许多研究和临床应用的实验设计都涉及成熟卵母细胞在显微操作和授精前的体外培养。因此,研究卵母细胞老化的机制并且调控卵母细胞老化无论对人类还是非人类动物的健康生殖都是非常重要的。老化卵母细胞最明显的特征包括对激活刺激敏感性的增加、MPF活性降低、后期II的启动、皮质颗粒部分胞吐、线粒体聚集、微管组装变化,并出现细胞凋亡的征兆,例如胞质和DNA断裂以及Bcl-2蛋白水平的降低。另外,老化的小鼠卵母细胞中组蛋白的某些赖氨酸位点乙酰化水平增加,而且由于老化过程中的氧化应激造成ROS的累积,并改变卵母细胞内的氧化还原状态,造成卵母细胞内总的GSH量减少以及GSH/GSSG比例的降低。我们之前的研究证明卵丘细胞能够促进小鼠卵母细胞老化。然而,卵丘细胞促进卵母细胞老化的确切机制还不清楚。据报道成熟卵母细胞能够代谢丙酮酸,并且在不含葡萄糖的培养基中卵丘卵母细胞复合体（COCs）比裸卵（DOs）消耗更多的丙酮酸。我们猜测卵母细胞在不含丙酮酸的条件下老化的更快,并且卵丘细胞可能通过消耗不含葡萄糖的CZB中的丙酮酸从而促进卵母细胞老化。为了验证这个猜测,我们将新排卵的小鼠卵母细胞培养在添加不同浓度丙酮酸的CZB中,然后进行激活处理或通过放射自显影的方法分析MPF活性。结果发现丙酮酸以剂量依赖性的方式降低COCs和DOs的激活率,而升高其MPF活性,卵丘细胞存在的情况下需要更多的丙酮酸。新鲜排卵的DOs培养在不另外添加丙酮酸的COCs条件化的CZB中,其激活率显著升高,MPF活性显著降低,然而,当在条件化培养基中添加10 mM丙酮酸后,DOs的激活率和MPF活性都与新鲜卵母细胞无差别。我们通过毛细管电泳试验证明,COCs和卵丘细胞单层制备的CZB条件化培养基中丙酮酸的含量显著低于新鲜制备的CZB、单独培养的CZB以及DOs条件化的CZB中丙酮酸的含量。这些结果有力地验证了我们的猜测:在不含葡萄糖的培养液中卵丘细胞通过消耗丙酮酸从而促进卵母细胞老化。为了检测丙酮酸对卵母细胞其他老化指标的影响,我们通过免疫荧光显微镜检查法观察了皮质颗粒的提前胞吐、线粒体分布、微管组装、抗凋亡蛋白Bcl-2水平、组蛋白乙酰化水平,通过Hoechst33342染色观察了后期II的启动,通过体外受精及其随后的胚胎发育能力检测了丙酮酸对老化卵母细胞发育潜力的影响。结果证明,丙酮酸能够显著抑制老化卵母细胞皮质颗粒的提前胞吐、线粒体聚集、微管组装的变化;并且显著抑制了Bcl-2、组蛋白乙酰化水平以及胞质碎裂比例的升高,说明丙酮酸能够显著抑制老化小鼠卵母细胞的凋亡。另外,我们的数据还证明老化过程中添加丙酮酸能够显著抑制老化对卵母细胞受精及其发育能力所造成的损伤。这些数据表明,丙酮酸能够显著抑制COCs和DOs的老化。为了验证丙酮酸是否通过其抗氧化作用从而抑制卵母细胞老化,我们通过2’,7’-dichlorodihydrofluorescein diacetate （DCHFDA）染色的方法检测了老化卵母细胞内ROS的水平,并通过DTNB-GSSG还原酶实验检测了老化卵母细胞内总GSH、还原型GSH水平以及GSH/GSSG比例。结果表明,丙酮酸能够显著抑制老化卵母细胞中ROS水平的增加,并且能够显著抑制总GSH和GSH水平以及GSH/GSSG比例的降低。这些数据表明,丙酮酸可能通过其抗氧化作用维持细胞内的氧化还原水平,显著削弱卵母细胞老化过程中的氧化应激对其造成的损伤。因此,我们得出结论:丙酮酸能够抑制小鼠COCs和DOs的老化,卵丘细胞通过消耗培养液中的丙酮酸从而促进卵母细胞老化。而且,从我们现在的数据可以看出,很显然在卵母细胞老化过程中添加丙酮酸能够显著提高排卵后老化卵母细胞的质量,并降低其凋亡指标。丙酮酸很可能通过其抗氧化作用从而维持卵母细胞GSH/GSSG比例,并阻止总GSH含量的降低以及胞质内ROS水平的升高,从而显著抑制凋亡的发生。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 卵母细胞老化的机理
• 1.2 卵母细胞老化过程中所发生的分子、生化和细胞学的变化
• 1.2.1 ROS
• 1.2.2 钙离子平衡
• 1.2.3 线粒体
• 1.2.4 GSH
• 1.2.5 ATP
• 1.2.6 Bcl-2
• 1.2.7 组蛋白乙酰化
• 1.2.8 MPF 和MAPK
• 1.2.9 细胞骨架纤维
• 1.2.10 皮质颗粒
• 1.2.11 老化卵母细胞对孤雌激活的敏感性升高
• 1.2.12 胞质碎裂
• 1.2.13 卵母细胞老化对受精和胚胎发育的影响
• 1.3 卵丘细胞对卵母细胞老化的影响
• 1.4 卵母细胞老化的调控
• 1.5 丙酮酸的作用
• 1.5.1 丙酮酸作为能量物质
• 1.5.2 丙酮酸作为抗氧化剂
• 1.5.3 丙酮酸可能作为一种潜在的信使调节细胞内的钙离子信号
• 2 材料与方法
• 2.1 主要试剂及配制
• 2.2 实验动物及超排处理
• 2.3 体内成熟卵母细胞的获取
• 2.4 卵母细胞体外老化处理
• 2.5 卵丘颗粒细胞单层的培养
• 2.6 条件化培养基的制备
• 2.7 卵母细胞的孤雌激活
• 2.8 卵母细胞的体外受精
• 2.9 胚胎培养
• 2.10 透明带硬化测试
• 2.11 MPF 活性检测
• 2.11.1 实验材料的制备
• 2.11.2 蛋白磷酸化反应
• 2.11.3 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.11.4 放射自显影
• 2.11.5 MPF 活性的定量分析
• 2.12 毛细管电泳检测培养液中丙酮酸浓度
• 2.13 观察核构型和胞质碎裂
• 2.14 卵母细胞谷胱甘肽含量的测定
• 2.15 卵母细胞内ROS 水平的检测
• 2.16 免疫荧光显微镜检查法
• 2.16.1 皮质颗粒染色
• 2.16.2 卵母细胞α－微管蛋白染色
• 2.16.3 卵母细胞线粒体染色
• 2.16.4 Bcl-2 蛋白染色
• 2.16.5 组蛋白乙酰化染色
• 2.17 激光扫描共聚焦显微术
• 2.18 实验设计
• 2.19 数据统计分析
• 3 结果与分析
• 3.1 卵丘细胞通过消耗丙酮酸促进卵母细胞老化
• 3.1.1 丙酮酸能够降低老化卵母细胞的激活率并升高其MPF 活性
• 3.1.2 条件化培养基中低的丙酮酸含量是其促卵母细胞老化作用的原因
• 3.2 老化过程中添加丙酮酸能够缓解老化过程对卵母细胞受精及发育能力的影响
• 3.2.1 老化过程中添加不同浓度的丙酮酸对COCs和DOs体外老化后体外受精及其胚胎发育能力的影响
• 3.2.2 丙酮酸、MG132 和咖啡因抑制卵母细胞老化后对卵母细胞受精及发育能力的影响
• 3.3 丙酮酸能够抑制老化卵母细胞中皮质颗粒的提前胞吐
• 3.4 丙酮酸能够缓解老化过程中透明带的硬化
• 3.5 丙酮酸增加老化卵母细胞中抗凋亡蛋白BCL-2 的水平
• 3.6 老化过程中添加丙酮酸对卵母细胞GSH 水平的影响
• 3.7 老化过程中添加丙酮酸对卵母细胞中ROS 水平的影响
• 3.8 丙酮酸降低老化卵母细胞中的组蛋白乙酰化水平
• 3.9 丙酮酸对老化卵母细胞核构型和胞质碎裂的影响
• 3.10 老化过程中添加丙酮酸对线粒体分布的影响
• 3.11 老化过程中添加丙酮酸对胞质微管组装的影响
• 4 讨论
• 4.1 卵丘细胞通过消耗丙酮酸抑制卵母细胞孤雌激活率升高和MPF 活性降低
• 4.2 丙酮酸通过维持卵母细胞的氧化还原状态从而抑制氧化应激对卵母细胞的损伤
• 4.3 丙酮酸抑制老化卵母细胞中组蛋白的乙酰化
• 4.4 丙酮酸能够抑制老化卵母细胞超微结构的变化
• 4.4.1 丙酮酸能够抑制老化卵母细胞的线粒体聚集
• 4.4.2 丙酮酸能够抑制卵母细胞老化过程中CG 的丢失
• 4.4.3 丙酮酸能够抑制卵母细胞老化过程中微管组装的变化
• 4.5 丙酮酸缓解老化对卵母细胞受精及发育能力所造成的损伤
• 5 结论
• 参考文献
• 附录：图版及图版说明
• 致谢
• 作者简介及发表论文情况