赭曲霉毒素A和黄曲霉毒素B1的超微量免疫分析

论文摘要

目的采用时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）技术,建立赭曲霉毒素A（OTA）和黄曲霉毒素B1（AFB1）的高灵敏的TRFIA的检测方法,并研制具有我国自主知识产权的快速、灵敏的OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA检测试剂盒,提高我国在毒素超微量免疫检测的水平,解决我国农产品安全检测方面的一些迫切要求,应对国际上技术壁垒的挑战。方法1. OTA的TRFIA研究:首先采用碳二亚胺法,制备人工抗原OTA-KLH。以OTA-KLH免疫大白兔制备多克隆抗体。以OTA-BSA免疫BALB/c鼠,制备抗OTA单克隆抗体。选择包被浓度、标记条件、反应步骤、反应方式,配制增强液、洗液,编制全自动操作软件;以稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪,建立多克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA。以稀土离子Eu3+标记的羊抗鼠抗体进行示踪,建立单克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA。组建OTA-TRFIA检测试剂盒。按照标记免疫试剂要求,分别对OTA-TRFIA试剂盒进行灵敏度、精密度、准确度、回收率、特异性、稳定性考核,应用OTA-TRFIA试剂盒检测国际质控,并与进口的OTA-ELISA试剂盒进行对照。2. AFB1的TRFIA研究:将AFB1-BSA免疫新西兰大白兔得到抗AFB1多克隆抗体。用黄曲霉毒素B1与辣根过氧化酶的联结物（AFB1-HRP）包被96孔板为固相抗原,以稀土离子Eu3+标记的羊抗兔抗体进行示踪,采用间接竞争免疫分析方法建立AFB1-TRFIA。组建AFB1-TRFIA检测试剂盒,对其进行考核,并与ELISA试剂盒进行对照。结果1.制备了可以用于免疫和筛选的OTA-KLH人工抗原,得到了抗OTA多克隆抗体和单克隆抗体。采用DTTA法,制备了Eu3+-羊抗兔抗体和Eu3+-羊抗鼠抗体。配制了所有的相关试剂,编制了全自动的分析软件,组建了OTA-TRFIA、AFB1-TRFIA检测试剂盒。2.应用多克隆抗体建立的OTA-TRFIA方法的灵敏度为0.02μg /L,测量范围为0.02μg /L -400μg /L,批内和批间变异分别为2.6%和5.2%,平均回收率为95.8%。OTA-TRFIA的效应点值ED80、ED50、ED20分别为0.195g/L, 1.018g/L和5.314g/L。3.应用单克隆抗体建立的OTA-TRFIA方法的灵敏度为0.03μg /L,测量范围为0.03μg /L -1000μg /L,批内和批间变异分别为3.7%和5.3%,平均回收率为94.2%。间接竞争

论文目录

• 主要缩略词
• 摘要
• Abstract
• 第一章 绪论
• 1.1 概述
• 1.2 真菌毒素的危害
• 1.3 赭曲霉毒素 A 概述
• 1.3.1 赭曲霉毒素 A 的危害
• 1.3.2 国内外赭曲霉毒素 A 限量标准进展
• 1.3.3 国内外赭曲霉毒素 A 的检测方法进展
• 1概述'>1.4 黄曲霉毒素B₁概述
• 1的危害'>1.4.1 黄曲霉毒素B₁的危害
• 1限量标准进展'>1.4.2 国内外黄曲霉毒素B₁限量标准进展
• 1的检测方法进展'>1.4.3 国内外黄曲霉毒素B₁的检测方法进展
• 1.5 标记免疫分析发展方向
• 1.6 时间分辨荧光免疫分析
• 1.6.1 时间分辨荧光免疫分析的原理
• 1.6.2 时间分辨荧光免疫分析的标记
• 1.6.3 时间分辨荧光免疫分析的方法
• 1.6.4 时间分辨荧光分析测量仪器
• 1.7 课题的立题目的和意义
• 1.8 研究的主要内容
• 参考文献
• 第二章 抗赭曲霉毒素 A 抗体的制备
• 2.1 引言
• 2.2 材料与仪器
• 2.2.1 材料
• 2.2.2 仪器
• 2.3 人工抗原 OTA-KLH 的制备
• 2.3.1 OTA-KLH 制备步骤
• 2.3.2 OTA-KLH 偶联的确证
• 2.4 抗赭曲霉毒素 A 多克隆抗体的制备
• 2.4.1 原理
• 2.4.2 油包水抗原乳化剂的制备
• 2.4.3 免疫新西兰大白兔
• 2.5 抗赭曲霉毒素 A 多克隆抗体的鉴定
• 2.5.1 抗赭曲霉毒素 A 多克隆抗体滴度的测定
• 2.5.2 抗赭曲霉毒素 A 多克隆抗体特异性初步验证
• 2.6 抗赭曲霉毒素 A 单克隆抗体的制备
• 2.6.1 制备流程
• 2.6.2 OTA-BSA 免疫 BALB/c 鼠做融合
• 2.7 结果和讨论
• 2.7.1 OTA-KLH 偶联的结果
• 2.7.2 抗赭曲霉毒素 A 多克隆抗体的制备和鉴定结果
• 2.7.3 抗赭曲霉毒素 A 单克隆抗体的制备和鉴定结果
• 2.7.4 单克隆抗体和多克隆抗体的各自特点
• 2.8 本章小结
• 参考文献
• 第三章 赭曲霉毒素 A 时间分辨荧光免疫分析方法的建立
• 3.1 引言
• 3.2 材料与方法
• 3.2.1 材料
• 3.2.2 主要仪器
• 3.3 应用多克隆抗体建立赭曲霉毒素A的时间分辨荧光免疫分析
• 3.3.1 固相抗原包被条件的优化
• 3+-羊抗兔抗体的制备'>3.3.2 Eu³⁺-羊抗兔抗体的制备
• 3.3.3 OTA 标准的配制
• 3.3.4 抗 OTA 兔血清的稀释实验
• 3.3.5 间接竞争 OTA-TRFIA 检测步骤
• 3.4 应用单克隆抗体建立赭曲霉毒素 A 的时间分辨荧光免疫分析
• 3.4.1 固相抗原的包被
• 3.4.2 羊抗鼠抗体包被板的制备
• 3+-标记物的制备'>3.4.3 Eu³⁺-标记物的制备
• 3.4.4 抗 OTA 腹水的稀释实验
• 3.4.5 免疫分析检测步骤
• 3.5 结果与讨论
• 3.5.1 多克隆抗体 OTA-TRFIA 中固相抗原包被条件优化的结果
• 3+-羊抗兔抗体制备的条件优化'>3.5.2 Eu³⁺-羊抗兔抗体制备的条件优化
• 3+标记抗体的分离纯化'>3.5.3 Eu³⁺标记抗体的分离纯化
• 3+标记抗体的标记率'>3.5.4 Eu³⁺标记抗体的标记率
• 3+标记抗体得率的提高'>3.5.5 Eu³⁺标记抗体得率的提高
• 3.5.6 OTA-BSA 包被浓度对多克隆抗体 OTA-TRFIA 的影响
• 3.5.7 抗 OTA 兔血清的稀释实验
• 3.5.8 反应温度和反应时间对 OTA-TRFIA 检测的影响
• 3.5.9 应用多克隆抗体建立间接竞争OTA-TRFIA的标准曲线
• 3.5.10 免疫分析检测步骤结果
• 3.5.11 应用单克隆抗体建立 OTA-TRFIA 时包被浓度的选择
• 3.5.12 抗 OTA 腹水的稀释实验
• 3.5.13 应用单克隆抗体建立间接竞争 OTA-TRFIA 的标准曲线
• 3.6 本章小结
• 参考文献
• 第四章 赭曲霉毒素 A 时间分辨荧光免疫分析试剂盒的研制及考核
• 4.1 引言
• 4.2 材料与方法
• 4.2.1 材料
• 4.2.2 主要仪器
• 4.3 主要试剂的配制
• 4.3.1 OTA 标准溶液
• 4.3.2 分析缓冲液的配制
• 4.3.3 浓缩洗涤液的配制
• 4.3.4 增强液主要成分的合成及配制
• 4.3.5 抗 OTA 腹水分装
• 4.3.6 抗 OTA 兔血清分装
• 3+-羊抗鼠抗体分装'>4.3.7 Eu³⁺-羊抗鼠抗体分装
• 3+-羊抗兔抗体分装'>4.3.8 Eu³⁺-羊抗兔抗体分装
• 4.3.9 包被板
• 4.4 样品处理
• 4.5 应用单克隆抗体间接竞争 OTA-TRFIA 试剂盒组成及检测步骤
• 4.5.1 试剂盒的组成
• 4.5.2 检测步骤
• 4.6 应用多克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA试剂盒组成及检测步骤
• 4.6.1 试剂盒的组成
• 4.6.2 应用多克隆抗体间接竞争OTA-TRFIA检测步骤
• 4.7 全自动操作OTA-TRFIA程序及试剂盒
• 4.8 方法的考核
• 4.9 结果与讨论
• 4.9.1 增强液的配制结果
• 4.9.2 应用单克隆抗体间接竞争 OTA-TRFIA 试剂盒的考核
• 4.9.3 应用多克隆抗体间接竞争 OTA-TRFIA 试剂盒的考核
• 4.10 本章小结
• 参考文献
• 1时间分辨荧光免疫分析法的建立及试剂盒的研制--'>第五章 黄曲霉毒素B₁时间分辨荧光免疫分析法的建立及试剂盒的研制--
• 5.1 引言
• 5.2 材料与方法
• 5.2.1 材料
• 5.2.2 主要仪器
• 5.3 实验方法
• 1多克隆抗体的制备'>5.3.1 抗AFB₁多克隆抗体的制备
• 5.3.2 固相抗原制备
• 3+-羊抗兔抗体的制备'>5.3.3 Eu³⁺-羊抗兔抗体的制备
• 1标准的配制'>5.3.4 AFB₁标准的配制
• 1分析缓冲液'>5.3.5 AFB₁分析缓冲液
• 5.3.6 洗涤液的配制
• 1-TRFIA检测步骤'>5.3.8 间接竞争AFB₁-TRFIA检测步骤
• 5.4 结果与讨论
• 1兔血清的稀释实验'>5.4.1 抗AFB₁兔血清的稀释实验
• 3+-羊抗兔抗体的浓度选择'>5.4.2 Eu³⁺-羊抗兔抗体的浓度选择
• 1-HRP固相抗原包被量的优化'>5.4.3 AFB₁-HRP固相抗原包被量的优化
• 5.4.4 加样顺序对AFB-TRFIA灵敏度的影响
• 5.4.5 灵敏度的影响因素
• 5.4.6 标准点的设置
• 5.4.7 标准曲线的数学模型
• 5.4.8 标准曲线的拟和方式
• 1的时间分辨荧光免疫分析试剂盒'>5.4.9 黄曲霉毒素B₁的时间分辨荧光免疫分析试剂盒
• 5.5 本章小结
• 参考文献
• 1时间分辨荧光免疫分析试剂盒方法学考核'>第六章 黄曲霉毒素B₁时间分辨荧光免疫分析试剂盒方法学考核
• 6.1 引言
• 6.2 材料与方法
• 6.2.1 材料
• 6.2.2 主要仪器
• 6.3 实验方法
• 6.3.1 样品制备和提取
• 6.3.2 测试步骤
• 6.3.3 AFB-TRFIA的考核方法
• 6.4 结果与讨论
• 6.4.1 标准曲线
• 6.4.2 标准曲线的批间稳定性
• 6.4.3 灵敏度和测量范围
• 6.4.4 特异性
• 6.4.5 精密度
• 6.4.6 回收率
• 6.4.7 有效期
• 1-TRFIA与AFB₁-ELISA试剂盒的比较'>6.4.8 AFB₁-TRFIA与AFB₁-ELISA试剂盒的比较
• 6.5 本章小结
• 参考文献
• 总结
• 主要创新点
• 致谢
• 攻读博士学位期间发表的论文
• 攻读博士学位期间申请专利
• 攻读博士学位期间鉴定课题