论文题目: 猪脂蛋白脂酶（LPL）和激素敏感脂肪酶（HSL）基因的序列和多态性分析及体外表达的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 动物遗传育种与繁殖
作者: 张振波
导师: 邓昌彦,熊远著
关键词: 脂蛋白脂酶,激素敏感脂肪酶,多态性,大肠杆菌表达,巴斯德毕赤酵母表达,酶活性检测
文献来源: 华中农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 在现代动物育种实践中,通过在分子水平上识别控制重要经济性状的遗传标记或者基因座,以便在早期或超早期直接对个体进行选择是一种极为重要的手段,也是为广大育种工作者广泛采用的一种方法。这种借助分子标记辅助选择（MAS）进行猪的遗传改良、提高猪的生产性能的方式的前提是必须找到尽可能多的合适的遗传标记信息。 本实验以脂蛋白脂酶（LPL）和激素敏感脂肪酶（HSL）基因作为猪脂肪代谢相关性状的侯选基因,主要着眼于发现新的单核苷酸多态性（SingleNucleotide Polymorphisms, SNPs）位点和有效的分子标记信息。同时也开展了猪LPL和HSL基因的原核和真核的体外表达,为通过基因工程的手段来调控猪脂肪代谢的研究做了初步的探索。主要研究结果如下: 1.通过提取不同品种猪的脂肪组织的RNA、进行RT-PCR,得到不同品种猪的HSL和LPL基因的全长cDNA序列。利用CLUSTALW软件对猪和从Genbank数据库中所搜寻到的相关动物物种的HSL和LPL基因进行进化树分析,初步了解基因在不同物种中的亲缘关系。 2.根据已测的LPL基因的外显子序列扩增并克隆LPL基因内含子3、5,BLAST比对发现有20处SNPs,选取直接导致限制性酶切位点的SNPs进行多态性与性状的关联研究。 3.在F2群体中,内含子3的NheI酶切位点的AA、AB、BB三种基因型在皮率、眼肌高性状上存在显著性（p<0.05）和极显著性（p<0.01）的差异。均表现为加性效应的作用方式,且达极显著水平。 4.内含子3中的EcoT22I酶切位点在F2群体中的研究发现,AA、BB基因型在6-7肋处膘厚、皮厚、骨率性状上达到显著性（p<0.05）和极显著性（p<0.01）。均以加性效应作用为主,达到了显著性水平（P<0.05）。 5.在F2猪群体中,内含子3中的NcoI酶切位点的AA、AB、BB基因型在胴体性状的眼肌高、眼肌宽、眼肌面积上均达到显著性水平（p<0.05）。眼肌高是以加性效应的方式为主的（p<0.05）;而眼肌宽、眼肌面积则以显性效应作用方式为主的（p<0.05）。在肉质性状上NcoI酶切位点的三种基因型在pH（LD）、pH（BF）、色值（BF）、肌内脂肪上达到显著性（p<0.05）和极显著性（p<0.01）水平。是以显性效应为主的（p<0.05）。 6.内含子5中的AfaI位点的三种基因型在F2群体胴体性状的屠宰率和胸腰部膘厚上存在着显著性差异（p<0.05）。以加性效应方式为主,但未达显著性水平。而在AfaI位点的肉质性状上,三种基因型在pH（LD）、pH（BF）、pH
论文目录:
摘要
Abstract
第一章 文献综述
1 导言
1．1 概述
1．2 分子育种研究策略
1．3 主要的分子标记
1．3．1 RFLP标记
1．3．2 RAPD标记
1．3．3 微卫星标记
1．3．4 AFLP标记
1．3．5 PCR-SSCP
1．3．6 SNP标记
1．4 分子标记在动物遗传育种中的应用
1．4．1 遗传多样性的研究
1．4．2 基因图谱的构建
1．4．3 猪的起源及群体亲缘关系的研究
1．4．4 猪的抗病育种
1．4．5 标记辅助选择
1．4．6 标记辅助导入
2 影响脂肪代谢的重要候选基因
2．1 心脏脂肪酸结合蛋白基因
2．1．1 H-FABP基因的序列分析及其定位
2．1．2 H-FABP基因的遗传变异
2．1．3 猪的H-BFAP基因的遗传变异及其与肌内脂肪含量的关系
2．2 脂肪组织脂肪酸结合蛋白基因
2．3 OB基因
2．4 MO4R
2．5 过氧化物酶增殖体激活受体γ(PPARγ)基因
3 HSL和 LPL是影响脂肪代谢的重要候选基因
3．1 激素敏感脂肪酶
3．1．1 HSL特性
3．1．2 HSL基因分子生物学的研究进展
3．1．3 HSL基因的分子结构特点
3．2 脂蛋白脂酶
3．2．1 特性
3．2．2 LPL基因的定位及序列分析
3．2．3 LPL基因分子生物学的研究进展
第二章 实验目的和意义
第三章 材料和方法
1 材料
1．1 试验猪群与性状测定
1．2 主要仪器和设备
1．3 主要试剂
1．4 缓冲液和常用试剂的配制
2 实验方法
2．1 猪基因组 DNA的提取
2．2 基因组 DNA的浓度测定和质量检测
2．3 实验引物设计
2．4 样品采集及猪脂肪组织总 RNA的提取
2．4．1 样品的采集
2．4．2 脂肪组织总 RNA的提取
2．4．3 RNA变性电泳
2．5 不同品种猪cDNA第一链的合成
2．5．1 RT-PCR试剂
2．5．2 RT-PCR反应体系
2．5．3 RT-PCR反应产物的检测
2．6 RT-PCR产物的回收、纯化、克隆测序
2．6．1 RT-PCR产物回收与纯化
2．6．2 RT-PCR产物的克隆
2．6．3 感受态细胞的制备
2．6．4 连接产物的转化
2．6．5 阳性克隆子鉴定及测序
2．7 LPL内含子3、5及 PCR-RFLP扩增引物
2．7．1 引物设计
2．7．2 PCR扩增
2．7．3 PCR反应条件
2．7．4 PCR产物及酶切后的检测
2．8 数据处理分析
2．8．1 统计软件
2．8．2 基因效应统计分析模型
第四章 结果与分析
4．1 脂肪组织总 RNA的提取
4．2 RT-PCR扩增结果
4．3 不同品种猪cDNA片段的克隆、测序及序列分析
4．4 LPL内含子3、5的扩增和序列测定
4．5 LPL内含子3、5的多态性与性状间的关系
4．5．1 LPL基因内含子3中NheI中多态性位点的遗传效应分析
4．5．2 LPL基因内含子3中EcoT22I中多态性位点的遗传效应分析
4．5．3 LPL基因内含子3中NcoI中多态性位点的遗传效应分析
4．5．4 LPL基因内含子5中AfaI中多态性位点的遗传效应分析
4．5．5 LPL基因内含子5中ScaI中多态性位点的遗传效应分析
第五章 讨论
5．1 脂肪组织 RNA的提取
5．2 RT-PCR及 PCR产物的克隆
5．3 关于HSL和 LPLcDNA的进化树分析
5．4 关于内含子3、5中的 SNPs
第六章 结论
第七章 HSL和LPL基因的克隆表达
7．1 大肠杆菌表达系统
7．2 原核表达载体的基本类型
7．3 大肠杆菌的表达产物
7．3．1 表达产物的处理-超声波处理法
7．3．2 可溶性表达产物的提取
7．3．3 包涵体的形成
7．3．4 包涵体的复性和纯化
7．4 嗜甲醇酵母巴斯德毕赤酵母表达系统
7．4．1 巴斯德毕赤酵母
7．4．2 表达载体
7．4．3 受体菌
7．4．4 表达载体与 R．pastoris基因组整合
7．4．5 巴斯德毕赤酵母表达菌株的生长
7．4．6 分泌蛋白的翻译后修饰
7．5 研究的目的意义
第八章 材料与方法
8．1 实验材料
8．1．1 载体及菌株
8．1．2 实验所用引物
8．1．3 主要药品、试剂及溶液的配制
8．1．3．1 工具酶
8．1．3．2 抗生素类
8．1．3．3 细菌培养基
8．1．3．4 质粒抽提
8．1．3．5 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
8．1．3．6 包涵体的提取相关溶液
8．1．3．7 其它缓冲液
8．2 实验方法
8．2．1 质粒的小量制备
8．2．2 重组质粒的鉴定
8．2．2．1 重组质粒的快速鉴定
8．2．2．2 重组质粒的酶切鉴定
8．2．3 诱导表达
8．2．4 表达蛋白的鉴定
8．2．4．1 重组菌菌体的裂解
8．2．4．2 SDS-PAGE
8．2．5 包涵体提取
8．2．6 不可溶性表达产物的溶解和复性
8．2．7 SDS-PAGE电泳
8．2．8 LPL 酶活性测定
第九章 结果与分析
9．1 HSL和LPL基因编码序列的 PCR扩增、克隆
9．2 表达质粒的构建与鉴定
9．2．1 LPL基因的表达载体的构建
9．2．2 HSL基因的表达质粒的构建
9．3 HSL和 LPL重组菌菌体裂解物的 SDS-PAGE电泳结果
9．4 包涵体的提取及检测
9．5 LPL表达产物酶活性的检测
9．6 酵母表达载体的构建与鉴定
9．6．1 酵母表达引物的扩增
9．6．2 HSL和LPL目的片段与表达载体的连接
9．6．3 重组酵母表达载体的酶切鉴定
9．7 pPIC9K-HSL/pPIC9K-LPL在巴斯德毕赤酵母菌中的诱导表达
9．8 蛋白浓度测定
9．9 LPL表达产物酶活性的检测
第十章 讨论
10．1 表达产物的提取
10．2 影响包涵体形成的因素
10．3 包涵体的纯化
10．4 包涵体的溶解及复性
10．5 酵母表达蛋白的糖基化分析
第十一章 小结
参考文献
附录
致谢
发布时间: 2005-12-05
参考文献
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