融合在外源蛋白羧基端的Tat蛋白转导结构域的跨膜递送作用研究

论文摘要

Tat（Trans-activator transcription）蛋白的蛋白转导区域（Protein transduction domain,PTD）——PTD-Tat 能介导其融合的蛋白的转导及细胞内定位。就理论而言,较之 N 端融合,PTD-Tat 的 C 端融合更有利于外源蛋白的表达。因此,对融合在外源蛋白 C 端的跨膜递送作用进行探讨具有研究意义。 本研究用 DNA 重组技术将 PTD-Tat 融合在绿色荧光蛋白（green fluorescence protein ,GFP）的羧基（C）端,构建重组表达质粒 pGEX-GFP-Tat;转化大肠杆菌 BL21（DE3）,IPTG 诱导其表达后,采用谷胱甘肽-Sepharose 4B（GS-4B）亲和层析,获得纯化的谷胱甘肽 S-转移酶（GST）融合的重组蛋白GST-GFP-Tat;用于研究融合在外源蛋白 C 端的 PTD-Tat 的跨膜递送作用。 通过融合蛋白 GST-GFP-Tat 与体外培养的 Hela 细胞共培养,荧光显微镜观察和流式细胞仪分析表明:其一,融合蛋白 GST-GFP-Tat 能高效地跨膜进入细胞,且定位于细胞核周围。其二,其跨膜递送与时间、浓度有依赖关系,即 37℃条件下 15min 细胞内可观察到绿色荧光,且荧光强度随着蛋白浓度的增高而增强。其三,温度对跨膜递送作用影响较大,37℃条件下有高跨膜效率的融合蛋白 4 ℃时跨膜递送作用几乎完全被抑制。其四,细胞膜表面的硫酸乙酰肝素（Heparin sulfate ,HS）对 GST-GFP-Tat 的跨膜递送具有重大影响,而代谢抑制剂并不影响其跨膜递送。其五,MTT 实验表明该融合蛋白对细胞无毒性。 此外,本研究通过融合蛋白 GST-GFP-Tat 与 GFP 氨基（N）端含有 PTD-Tat的融合蛋白 GST-Tat-GFP 的阳性对照组的对比发现:流式细胞仪的分析显示 4.0 μmol/L 的蛋白浓度下 GST-GFP-Tat 的转导效率高达 80.0 %,而 GST-Tat-GFP的转导效率只有 32.9 %;荧光显微镜的观察结果与其一致。 最后,动物实验证明该融合蛋白具有跨膜递送的作用:其一,小鼠的皮肤涂抹实验表明 GST-GFP-Tat 能沿着毛囊进到皮肤的真皮层。其二,小鼠的腹腔注射实验则表明 GST-GFP-Tat 能有效递送到小鼠体内各个组织,甚至跨越小鼠的血脑屏障;与阳性对照组的 GST-Tat-GFP 的比对显示其荧光强度较强,尤其两种融合蛋白在跨越血脑屏障方面存在明显差异。其三,融合蛋白喂食线虫发现蛋白进入其整个消化道及其原体腔,且与喂食时间与蛋白浓度呈正相关关系。 通过对融合在 GFP 之 C、N 端的 PTD-Tat 跨膜递送的比较分析,表明 C 端融合之 PTD-Tat 同样具有介导外源蛋白的跨膜递送作用,不仅跨膜递送进入细胞,且实现组织水平上的成功应用;而且 C 端融合之 PTD-Tat 甚至表现出更强的跨膜活性;此外,融合蛋白对细胞未造成毒性。这些结论将为 PTD-Tat 在蛋白药物递送方面的有效应用提供理论指导。

论文目录

• 第一章 综述
• 1.1 PTD-Tat 的研究概况
• 1.1.1 背景简介
• 1.1.2 Tat 蛋白转导域（PTD-Tat）
• 1.1.3 PTD-Tat 的结构特征
• 1.1.4 跨膜递送机制的研究
• 1.1.5 PTD-TAT 的应用
• 1.1.6 研究前景展望
• 1.2 绿色荧光蛋白（green fluorescent ptotein,GFP）
• 1.2.1 GFP 的研究进展
• 1.2.1.1 GFP 的发展史
• 1.2.1.2 GFP 的结构、生化及光谱特性
• 1.2.1.3 GFP 的改进
• 1.2.2 GFP 应用
• 1.2.2.1 筛选标记
• 1.2.2.2 实时定位标记
• 1.2.2.3 免疫学标记
• 1.2.3 问题与展望
• 1.3 本课题的研究思路及其研究意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验流程
• 2.2 实验试剂和材料
• 2.2.1 质粒、菌株、细胞株和动物
• 2.2.2 主要药品和试剂
• 2.2.3 培养基
• 2.2.4 常用溶液及缓冲液
• 2.2.5 主要使用仪器
• 2.3 表达质粒pGEX-GFP-Tat 的构建
• 2.3.1 基因片断的扩增
• 2.3.1.1 引物的设计与合成
• 2.3.1.2 PCR 扩增
• 2.3.1.3 扩增产物的回收
• 2.3.2 质粒载体pUCm-GFP-Tat 的构建
• 2.3.2.1 目的基因片断与pUCm-T 载体的连接
• 2.3.2.2 pUCm-GFP-Tat 质粒转化感受态大肠杆菌 DH5α
• 2.3.2.3 含有质粒pUCm-GFP-Tat 阳性克隆的筛选
• 2.3.2.3.1 蓝白筛选原理——α互补
• 2.3.2.3.2 质粒的鉴定
• 2.3.2.3.3 GFP-Tat 的回收
• 2.3.3 表达载体pGEX-GFP-Tat 的构建
• 2.3.3.1 GFP-Tat 与质粒pGEX-2T 的连接
• 2.3.3.2 pGEX-GFP-Tat 转化感受态大肠杆菌BL21（DE3）
• 2.3.3.3 表达菌株的筛选鉴定
• 2.4 融合蛋白GST-GFP-Tat 的表达、纯化与分析
• 2.4.1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 2.4.1.1 原理
• 2.4.1.2 溶液配制
• 2.4.1.3 实验步骤
• 2.4.2 融合蛋白GST-GFP-Tat 的表达
• 2.4.3 融合蛋白大量表达
• 2.4.4 谷胱甘肽琼脂糖亲和层析纯化融合蛋白GST-GFP-Tat
• 2.4.4.1 亲和纯化的原理
• 2.4.4.2 实验步骤
• 2.4.5 GST-GFP-Tat 的浓度测定——Folin–酚试剂法
• 2.4.5.1 原理
• 2.4.5.2 试剂
• 2.4.5.3 标准曲线的绘制
• 2.4.5.4 样品测定
• 2.4.6 Western blotting 鉴定
• 2.4.6.1 原理
• 2.4.6.2 材料与试剂
• 2.4.6.3 电泳转移装置
• 2.4.6.4 实验步骤
• 2.4.7 GST-GFP-Tat 荧光学特性研究
• 2.5 跨膜递送作用的研究
• 2.5.1 体外培养细胞的跨膜活性
• 2.5.1.1 跨膜活性的检测
• 2.5.1.1.1 细胞的培养
• 2.5.1.1.2 跨膜活性的定性分析——荧光显微镜
• 2.5.1.1.3 跨膜活性的定量分析——流式细胞计数仪（FACS）
• 2.5.1.2 GST-GFP-Tat 跨膜递送的动力学研究
• 2.5.1.2.1 浓度的影响
• 2.5.1.2.2 时间的影响
• 2.5.1.2.3 温度的影响
• 2.5.1.3 影响GST-GFP-Tat 跨膜递送的其他因素
• 2.5.1.4 GST-GFP-Tat 对细胞的毒性研究
• 2.5.1.4.1 GST-GFP-Tat 对细胞膜完整性的影响
• 2.5.1.4.2 GST-GFP-Tat 对细胞的毒性测定
• 2.5.2 小鼠体内的跨膜活性
• 2.5.2.1 皮肤涂抹实验
• 2.5.2.2 腹腔注射
• 2.5.3 GST-GFP-Tat 对线虫的影响
• 2.5.3.1 线虫实验
• 2.5.3.2 与GFP 以转染方式作用于线虫的结果比对
• 2.5.4 PTD-Tat 之C 端融合的跨膜活性与N 端融合的比较
• 2.5.4.1 细胞的跨膜活性对比
• 2.5.4.1.1 定性比较
• 2.5.4.1.2 定量比较
• 2.5.4.2 小鼠活体实验比对
• 2.5.4.3 GFP-Tat 与Tat-GFP 的结构模拟
• 第三章 结果与讨论
• 3.1 模型蛋白GST-GFP-Tat 的构建
• 3.1.1 目的基因的克隆与亚克隆
• 3.1.2 表达质粒pGEX-GFP-Tat 的构建
• 3.2 融合蛋白GST-GFP-Tat 的表达、纯化及荧光特性分析
• 3.2.1 融合蛋白 GST-GFP-Tat 的表达
• 3.2.2 融合蛋白GST-GFP-Tat 的大量表达
• 3.2.3 GS-48 亲和纯化融合蛋白GST-GFP-Tat
• 3.2.4 GST-GFP-Tat 的荧光学特性
• 3.3 融合蛋白GST-GFP-Tat 跨膜递送作用
• 3.3.1 在体外培养细胞中的跨膜活性
• 3.3.1.1 GST-GFP-Tat 跨膜递送的动力学研究
• 3.3.1.2 影响 GST-GFP-Tat 跨膜递送的其他因素
• 3.3.1.3 GST-GFP-Tat 对细胞的毒性研究
• 3.3.1.3.1 GST-GFP-Tat 对细胞膜完整性的影响
• 3.3.1.3.2 GST-GFP-Tat 对细胞的毒性测定
• 3.3.2 小鼠体内的跨膜活性
• 3.3.2.1 皮肤涂抹实验
• 3.3.2.2 腹腔注射
• 3.3.3 GST-GFP-Tat 对线虫的影响
• 3.3.4 PTD-Tat 之C 端融合的跨膜活性与N 端融合的比较
• 3.3.4.1 细胞的跨膜活性对比
• 3.3.4.2 小鼠活体实验比对
• 3.3.4.3 GFP-Tat 与Tat-GFP 的结构模拟
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录
• 1 GFP-Tat 的序列比对
• 2 测序彩图
• 个人简历、在学期间的研究成果及发表的学术论文