论文题目: 环糊精糖基转移酶和γ-环糊精生物合成的研究
论文类型: 博士论文
论文专业: 粮食,油脂与植物蛋白工程
作者: 曹新志
导师: 金征宇
关键词: 嗜碱芽孢杆菌,环糊精糖基转移酶,纯化,性质,化学修饰,环糊精,包合物
文献来源: 江南大学
发表年度: 2005
论文摘要: 对一株嗜碱芽孢杆菌Bacillus alkalophilus 1177进行了紫外和γ射线诱变选育,并采用酚酞变色圈快速筛选法筛选出的有较高环糊精糖基转移酶活性的菌株,其酶活提高了1.76倍。发酵实验结果表明酵母膏是培养基主要组成成分中影响酶产量的最主要因素。通过单因素试验和正交试验获得该菌株产环糊精糖基转移酶的最佳条件为:接种量3%;培养温度30℃;pH10.5;发酵培养基的组成为玉米粉2%,酵母膏1.5%,玉米浆5%;250ml三角瓶装液量为30ml;270rpm振荡培养3天,其发酵液酶活可达5400 U/ml。10升罐发酵也表明:酶活有显著提高,可达5820 U/ml。这比文献报道的酶活高。本实验通过一系列纯化步骤获得了电泳纯的环糊精葡萄糖基转移酶,粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Cellulose 52离子交换分层析、Sepharose CL-6B凝胶层析后,所得样品酶的比活力为5753U/mg,纯化倍数为9.54,回收率为18.9%。样品经DEAE-Cellulose52离子交换分层析后,SDS-PAGE电泳检测显示有多条蛋白带,表明还有一些杂蛋白质没有除去。样品经Sepharose CL-6B凝胶层析后,SDS-PAGE电泳检测显示只有一条蛋白带。表明已获得纯化的环糊精葡萄糖基转移酶。酶以淀粉为底物时的米氏常数Km为1.24mg/ml和最大反应速度Vmax 114.9μg/min。该Km较小,表明此酶对淀粉有较强的亲和力。并用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定其分子量为69kDa。我们用巯基乙醇和沸水分别处理环糊精葡萄糖基转移酶后,再用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法测定,两种方法获得的相对迁移率相同,这表明该酶没有亚基。并且该酶的其它酶学性质与以前报道的也不完全相同,这说明酶的来源不同,其酶的组成和性质也会不同。该酶的活力分别在pH5和pH8.5出现两个高峰,相对酶活分别达到97%和100%。该酶基本上在pH6.0-10.0范围内基本稳定,能维持酶活在90%以上。酶的最适温度为60℃;此酶在70℃以下基本保持稳定,高于70℃酶开始失活。说明该酶对温度不太敏感,稳定性较高。Ag+、Cu2+、Mg2+、Al3+、Co2+、Zn2+、Fe2+对酶活有明显的抑制作用,Sn2+、Mn2+对酶活力有一定的抑制作用,K+、Ca2+金属离子对酶活力没有影响。用几种蛋白质侧链修饰剂对环糊精糖基转移酶进行修饰,在一定反应条件下,该酶被氯氨-T（Ch-T）、丁二酮（DIC）、苯甲磺酰氟（PMSF）、二硫苏糖醇（DTT）和巯基乙醇（α-mercaptoethanol）修饰后,酶活力不受影响,说明蛋氨酸、精氨酸、氨基酸的羟基和巯基与酶活力无关。而该酶被焦碳酸二乙酯（DEP）、N-溴代琥珀酰亚胺（NBS）和羰二亚胺盐（EDC）修饰后,酶活力大幅度下降。表明有可能组氨酸残基、色氨酸残基
论文目录:
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
1.1 环糊精的概述
1.1.1 环糊精的物理化学性质与结构
1.1.2 环糊精的生产
1.1.2.1 CGTase 制备
1.1.2.2 淀粉的转化和环糊精的分离
1.1.3 环糊精的用途
1.1.4 环糊精的安全性评价
1.2 环糊精糖基转移酶的概述
1.2.1 环糊精糖基转移酶的性质
1.2.2 国内外研究概况
1.2.3 环糊精糖基转移酶的应用
1.2.3.1 制备葡萄糖基-L-抗坏血酸
1.2.3.2 一些黄酮类化合物的改性
1.2.3.3 甜味剂的改良
1.2.3.4 α-葡萄糖基橙皮甙的制备
1.3 立题依据和意义
1.4 本课题的研究内容
参考文献
第二章 产环糊精酶嗜碱芽孢杆菌株的筛选
2.1 前言
2.2 材料和方法
2.2.1 材料
2.2.2 主要实验仪器
2.2.3 方法
2.3 结果与讨论
2.3.1 菌种的诱变选育
2.3.1.1 CGTase 高产菌平板快速检出法
2.3.1.2 紫外线诱变结果
2.3.1.3 γ射线诱变结果
2.3.1.4 突变株7-12 菌株产酶稳定性
2.3.2 菌种发酵条件的研究
2.3.2.1 不同碳源对菌株产CGTase 的影响
2.3.2.2 不同氮源对菌株产CGTase 的影响
2.3.2.3 不同碳酸盐对菌株产CGTase 的影响
2.3.2.4 发酵工艺条件对产酶的影响
2.3.2.4.1 培养基初始pH 对菌株产CGTase 的影响
2.3.2.4.2 培养温度对产酶的影响
2.3.2.4.3 接种量对菌株产酶的影响
2.3.2.4.4 装液量和转速对菌株产酶的影响
2.3.2.5 正交试验优化培养基
2.3.2.6 嗜碱芽孢杆菌Bacillus alkalophilu512-7 发酵参数的测定
2.4 本章小结
参考文献
第三章 环糊精糖基转移酶的分离和纯化
3.1 前言
3.2 材料与方法
3.2.1 材料
3.2.2 主要仪器设备
3.2.3 实验方法
3.3 结果与讨论
3.3.1 硫酸铵分级沉淀
3.3.2 透析脱盐
3.3.3 DEAE-cellulose 52 层析
3.3.4 Sepharose CL-6B 层析
3.4 本章结论
参考文献
第四章 环糊精糖基转移酶的性质研究
4.1 前言
4.2 材料与方法
4.2.1 材料
4.2.2 主要实验仪器
4.2.3 方法
4.3 结果与讨论
4.3.1 聚丙烯酰胺电泳测定分子量
4.3.2 氨基酸的组成
4.3.3 环糊精糖基转移酶的反应动力学常数(Km 和Vm)的测定
4.3.4 环糊精糖基转移酶的最适pH 和pH 稳定性
4.3.5 环糊精糖基转移酶的最适温度及温度稳定性
4.3.6 金属离子对酶活的影响
4.4 本章小结
参考文献
第五章 环糊精糖基转移酶的化学修饰
5.1 前言
5.2 材料与方法
5.2.1 材料
5.2.2 主要仪器
5.2.3 方法
5.3 结果与讨论
5.3.1 精氨酸残基、羟基和蛋氨酸残基对酶活力的影响
5.3.2 色氨酸残基的化学修饰
5.3.2.1 不同pH 值条件下对酶与NBS 反应的影响
5.3.2.2 底物对酶的保护作用
5.3.2.3 CGTase 被NBS 修饰后的荧光光谱
5.3.3 组氨酸残基的化学修饰
5.3.4 -COOH 基团(Glu/Asp)的修饰
5.3.5 二硫苏糖醇对环糊精糖基转移酶的影响
5.4 本章小结
参考文献
第六章 影响合成γ-环糊精的因素
6.1 前言
6.2 材料与方法
6.2.1 材料
6.2.2 主要仪器设备
6.2.3 主要方法
6.3 结果与讨论
6.3.1 以淀粉为底物合成γ-CD 的影响因素
6.3.1.1 反应体系的pH 对产量的影响
6.3.1.2 反应体系的温度对γ-CD 产量的影响
6.3.1.3 反应体系酶量对γ-CD 产量的影响
6.3.1.4 淀粉种类对γ-CD 产量的影响
6.3.1.5 甘草酸对γ-CD 产量的影响
6.3.1.6 a-淀粉酶的影响(DE 值的影响)
6.3.1.7 脱支酶对γ-CD 产量的影响
6.3.1.8 酶反应时间在不同淀粉浓度对CD 的影响
6.3.1.9 响应面实验
6.3.2 利用β-CD 合成γ-CD 的反应
6.3.2.1 pH 对γ-CD 产量的影响
6.3.2.2 温度对γ-CD 产量的影响
6.3.2.3 酶量对γ-CD 产量的影响
6.3.2.4 酶反应时间对CD 的影响
6.3.2.5 底物浓度对γ-CD 产量的影响
6.3.2.6 甘草酸对γ-CD 产量的影响
6.3.2.7 葡萄糖和麦芽糖对γ-CD 产量的影响
6.3.2.8 CGTase 对β-CD 的耦合作用
6.4 本章小结
参考文献
第七章 γ-环糊精的鉴定分析
7.1 前言
7.2 仪器设备
7.3 主要方法
7.4 结果与讨论
7.4.1 环糊精纸层析分析
7.4.2 环糊精HPLC 分析
7.4.3 γ-环糊精红外光谱图
7.4.4 γ-环糊精的核磁共振(NMR)图
7.4.5 γ-环糊精的扫描电镜图
7.4.6 热分析
7.5 本章小结
参考文献
第八章 γ-环糊精包合维生素D2的研究
8.1 前言
8.2 材料与方法
8.2.1 材料
8.2.2 主要仪器设备
8.2.3 主要方法
8.3 结果与讨论
8.3.1 吸收光谱
8.3.2 红外光谱分析
8.3.3 差热扫描分析
8.3.4 相溶解度的测定
8.3.5 γ-CD与β-CD对维生素D的增溶效果比较
8.4 本章小结
参考文献
主要结论
论文创新点
致谢
攻读博士学位期间发表的论文
附录:符号及其意义
发布时间: 2006-07-20
参考文献
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- [2].红景天糖基转移酶家族基因克隆、鉴定及转基因发根系统的建立[D]. 于寒松.吉林大学2008
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- [4].分枝硫醇合成相关糖基转移酶和磷酸酶的研究及肽连接酶Butelasel的异源表达[D]. 郭玉川.山东大学2017
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- [6].杀念菌素生物合成中糖基转移酶的研究[D]. 雷璇.上海交通大学2013
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- [9].水稻乙二醛酶及木葡聚糖内糖基转移酶基因的生物学功能研究[D]. 曾正明.重庆大学2016
- [10].拟南芥和玉米糖基转移酶基因参与非生物胁迫耐性的功能研究[D]. 李攀.山东大学2017
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