西瓜AGPL1启动子果实特异调控机理的研究及在番茄遗传转化中的应用

论文摘要

植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase,ADP-glucose pyrophosphorylase）含有两个大亚基和两个小亚基。小亚基一般具有一个或两个异型体,在物种之间高度保守并在各组织中组成型表达;大亚基具有多个异型体并具有组织特异性表达的特征。刘敬梅等（2002）根据AGPase大亚基基因在西瓜（Citrullus vulgaris S.）果实中特异表达的现象,克隆到西瓜AGPase大亚基基因5′端1.8kb的序列AGPL1,发现该区段能引导报道基因在瞬时转化的西瓜果实和稳定转化的番茄果实中特异表达。本文对果实特异启动子AGPL1的调控机制进行了较为详细的研究。首先通过引物延伸法对西瓜AGPL1启动子进行转录起始位点定位,发现TATA-box下游33bp处的A为该基因转录的起始位点。为了从AGPL1启动子中分离与果实特异性表达相关的cis元件,我们通过PCR扩增对该启动子进行了一系列5′端和3′端缺失突变,并与gus基因（β-glucuronidase）融合构建瞬时表达载体,利用基因枪介导的瞬时转化研究该启动子在西瓜果实中的表达调控。结果表明在-868～+433之间1301bp的启动子片段具有最大的驱动活性,并保持果实特异地驱动功能。随着启动子5′端的连续缺失,该启动子在西瓜果实中的活性表现出下降趋势并直至丧失功能。在AGPL1启动子下游的5′-UTR中长度为323bp富含AT（65%）的内含子序列（+136～+459）能增强启动子在果实中的驱动活性,但对特异性表达的模式没有显著影响。将AGPL1启动子的系列缺失突变与GFP/RFP双荧光指示瞬时表达载体融合,在叶片中检测报道基因的活性。发现在-986～-959之间27bp和-464～-424之间41bp两个区段的缺失能引起该启动子在叶片表皮细胞中类似组成型表达,分别命名为PN1和PN2（putatively negative region 1 and 2）;而这两个区段的下游序列-892～-868和-424～-368之间24bp、56bp相继从5′端缺失时又能引起叶片中驱动活性丧失,分别命名为PP1和PP2（putatively positive region 1 and 2）。将PN1和PN2与CaMV 35S基本功能启动子融合,瞬时转化后抑制了基本启动子在叶片中的驱动活性,最终确定PN1和PN2是抑制AGPL1启动子在叶片中活性的关键区段。在凝胶迁移率分析实验中,PN1和PN2都能与西瓜叶片核蛋白结合形成特异的滞后条带,充分说明了这两个区段作为cis元件的调控作用;PP1和PP2与叶片核蛋白结合的现象充分验证了该正向调控序列的功能。根据上述现象,我们发现了与其他果实特异性启动子完全不同的调控机理,即西瓜果实特异性启动子AGPL1中存在cis元件抑制该启动子在果实外基因的表达,形成果实特异性的现象。为了更精确的分离cis调控元件中的核心碱基序列,我们通过4碱基内部缺失突变和单碱基突变的研究,发现PN1中起作用的cis元件序列为TC/TCAAAA,而且第11、12位的A是该元件的核心碱基;并在多种单子叶和双子叶植物中验证了该元件存在的普遍性。为了充分验证西瓜AGPL1果实特异性启动子的功能,我们将该启动子与番茄红素β-环化酶基因RNAi融合构建植物表达载体,对番茄进行稳定的遗传转化。在转化阳性植株中验证了该启动子的果实特异性表达特性,并获得了高番茄红素积累的番茄果实。

论文目录

• 致谢
• 摘要
• 缩略词表（Abbreviations）
• 目录
• 第1章 文献综述
• 1.真核基因的转录调控模式
• 1.1 基因调控的基本模式
• 1.2 基因活化
• 1.3 核心启动子的结构
• 2.植物启动子的研究进展
• 2.1 应用于植物的启动子类型
• 2.2 诱导型启动子
• 2.3 特异性启动子
• 3.果实特异性启动子
• 3.1 番茄PG启动子
• 3.2 番茄2A11启动子
• 3.3 番茄E4/E8启动子
• 3.4 番茄ACO1启动子
• 3.5 甜瓜cucumisin启动子
• 4.特异性相关元件的研究
• 5 果实特异性启动子的应用
• 5.1 改善果实品质
• 5.2 生产目的蛋白
• 5.3 改良果实农艺性状
• 6.植物转录因子
• 7.果实特异性启动子及其机理研究的意义
• 8.AGPase的研究进展
• 9.研究内容及技术路线
• 第2章 西瓜AGPL1启动子转录起始点的定位
• 1.材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 实验材料
• 1.3 TRIZOL一步法提取总RNA
• 1.4 mRNA的分离
• 1.5 引物和DNA marker标记
• 1.6 引物延伸反应
• 2.结果
• 3.讨论
• 第3章 GFP/RFP双荧光指示载体的构建与应用
• 1.材料方法
• 1.1 质粒载体与菌株
• 1.2 试剂与修饰酶
• 1.3 pBI221-RFP/GFP双荧光瞬时表达载体的构建
• 1.4 含CaMV 35S最小功能启动子RFP/GFP瞬时表达载体的构建
• 1.5 瞬时表达载体的功能验证
• 1.6 荧光显微成像
• 2.结果
• 2.1 构建RFP/GFP双荧光瞬时表达载体
• 2.2 pBI221-RFP/GFP载体的功能检测
• 2.3 pTobi-RFP/GFP瞬时表达载体的构建及功能检测
• 3.讨论
• 第4章 AGPL1启动子在西瓜果实中的表达调控
• 1.材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒载体与菌株
• 1.3 瞬时表达载体的构建
• 1.4 质粒DNA提取及基因枪介导的瞬时转化
• 1.5 GUS活性分析
• 2.结果分析
• 2.1 不同长度AGPL1启动子5`端缺失突变的构建
• 2.2 AGPL1启动子3`端内含子缺失突变瞬时表达载体的构建
• 2.3 AGPL1启动子5`端缺失突变对启动子功能影响的分析
• 2.4 内含子对基因表达增强作用的分析
• 2.5 不同区段启动子在转基因番茄中的功能研究
• 3.讨论
• 第5章 AGPL1启动子中特异性元件的分离
• 1.材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 质粒载体与菌株
• 1.3 瞬时表达载体的构建
• 1.4 推测功能元件与瞬时表达载体融合
• 1.5 质粒DNA提取及基因枪介导的瞬时转化
• 1.6 荧光显微成像
• 2.结果
• 2.1 AGPL1启动子5`-端和3`-端缺失突变瞬时表达载体的构建
• 2.2 AGPL1启动子不同缺失突变载体荧光活性分析
• 2.3 AGPL1启动子内部缺失突变瞬时表达载体的构建
• 2.4 AGPL1启动子精细突变瞬时表达载体的构建
• 2.5 AGPL1启动子内部缺失和精细突变的荧光活性分析
• 2.6 瞬时表达推测元件的功能分析
• 3.讨论
• 第6章 DNA凝胶迁移率变动分析
• 1.材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 试剂
• 1.3 核蛋白的提取
• 1.4 探针标记
• 1.5 凝胶迁移率分析（EMSA）
• 1.6 半干式电转膜
• 1.7 固相化核酸的检测
• 2.结果与分析
• 2.1 探针标记与显色效率检测
• 2.2 叶片核蛋白EMSA分析
• 2.3 PN1探针碱基缺失突变与核蛋白结合EMSA检测
• 2.4 PN1探针中单碱基突变与核蛋白结合EMSA检测
• 2.5 PN2探针中TC/TCAAAA元件与核蛋白结合EMSA检测
• 2.6 PN1探针与PN2、PP1、PP2元件的竞争性结合
• 2.7 包含cis元件的PN1与不同植物来源核蛋白的结合
• 3.讨论
• 第7章 AGPL1启动子在提高番茄果实中番茄红素含量的应用
• 1.材料与方法
• 1.1 材料与菌种
• 1.2 实验方法
• 2.结果
• 2.1 植物表达载体构建和遗传转化
• 2.2 转基因植株的检测
• 2.3 转化果实中番茄红素的含量测定
• 3.讨论
• 第8章 结论
• 1.西瓜AGPL1启动子是果实特异性启动子
• 2.PN1和PN2是AGPL1启动子特异调控的关键区段
• 3.西瓜AGPL1启动子中cis元件TC/TCAAAA
• 4.西瓜AGPL1启动子能实现外源基因在番茄果实中的特异表达
• 参考文献
• Abstracts